家蚕(Bombyx mori)是具有重要经济价值的驯化昆虫,同时也是鳞翅目模式昆虫,家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是对蚕业危害最为严重的家蚕病原微生物之一,由BmNPV引起的家蚕血液型脓病常对蚕业生产造成严重的经济损失。该病传染性强、难以控制,虽然传统的消毒方法能够在一定程度上预防该病的发生,但仍具有很大局限性。因此,对BmNPV的侵染机制、家蚕对BmNPV抗性机制和培育抗性家蚕素材的研究成为当前蚕学领域最为紧迫的课题。虽然BmNPV与宿主相互作用研究已取得了不少成果,许多参与家蚕与病毒互作和具有抗病毒功能的基因已被发现和鉴定,但是,对于BmNPV侵染家蚕过程的分子机制仍不十分清楚,在BmNPV感染家蚕的过程中有哪些宿主基因或通路参与?BmNPV如何通过调控宿主细胞以利于自身复制增殖?这一系列的问题都亟待进一步研究。本研究检测并鉴定了两种抗性差异家蚕品系871与871C对BmNPV的抗性差异和组织感染差异;分析了BmNPV在不同品系间的入侵和感染过程,并确定了BmNPV在抗性品系中被阻断的时期;进一步通过比较转录组学解析了871与871C抗性差异品系间的差异表达基因,并成功筛选得到一个具有显著抑制BmNPV复制增殖能力的差异候选基因。主要研究结果及结论如下:1.871与871C对BmNPV抗性的鉴定通过定量添食家蚕核型多角体病毒后家蚕死亡统计检测,871对BmNPV的半致死剂量(LD50)为3.8×103多角体/头,871C的半致死剂量为2.5×107多角体/头,871C较871对BmNPV感染呈明显抗性。通过添食病毒后(2×106多角体/头)家蚕存活曲线分析表明,871死亡高峰在第5天,871C死亡高峰在第8天,表明871C感染BmNPV后具有显著的死亡延后现象。皮下注射(2×104 BV/头)存活曲线分析表明,871在感染第8天几乎全部死亡(99%),而871C少量死亡(8%)。病征观察结果显示,871感染病毒后第3天出现体型变小、体重减轻现象,随后出现体形肿胀,体色乳白,狂躁爬行,皮破流脓的典型血液型脓病特征,然而在871C在感染BmNPV后在第5天与对照组出现差异,但未出现明显病症。通过解剖观察,发现871病蚕体内充满病毒多角体,脂肪体消融,中肠易破等现象;血细胞连续观察和统计结果分析显示,在感染后48 h,敏感品系871血细胞中即出现病毒多角体,并随时间推移多角体逐渐增多,感染后96h,血细胞内充满病毒多角体,且血液中存在较多游离病毒多角体。871C至感染后96 h观察到少量病毒多角体的产生。组织切片观察显示871中肠在感染后24 h出现细胞核膨大的病变现象,随后病变程度增加,到感染后96 h出现细胞核脱落现象。871C在感染BmNPV后,至96 h未观察到明显变化。基于上述实验分析,确定了871C与871对BmNPV的抗性差异。同时也确定后续实验经口感染剂量为2×106多角体/头,注射实验剂量为2×104 BV/头。2.BmNPV感染871与871C的过程及组织差异通过收集不同时间点两种家蚕品系的各个组织,通过q RT-PCR连续检测病毒基因表达水平,鉴定经口添食BmNPV在871与871C的感染过程。结果表明,871C经口感染后6 h,在家蚕中肠检测到病毒;12 h在血细胞和脂肪体检测到病毒;24 h头部和气管检测到病毒;48 h,表皮组织中检测到病毒;72 h检测到病毒感染丝腺及生殖腺。这些结果表明,BmNPV初始感染家蚕中肠,随后进入血液与脂肪体进行二次感染,进而感染家蚕头部、表皮和气管细胞,最后BmNPV感染家蚕丝腺与生殖腺。抗性品系871C与敏感品系871在BmNPV的感染过程中没有差异。利用q RT-PCR检测BmNPV在871与871C不同组织中病毒晚期基因vp39的表达水平,结果显示:同一品系的不同组织比较发现,家蚕血液和脂肪体感染程度最高,其次是中肠、头部、表皮和气管,丝腺和生殖腺的感染程度最低。不同品系间相同组织比较结果显示,871中vp39表达水平较871C均在2倍以上,表明BmNPV对871C与871的各个组织感染程度存在显出差异。通过带有EGFP荧光标签的示踪病毒观察病毒组织感染情况,结果进一步证实了组织感染的差异性。3.BmNPV侵染关键组织的差异分析杆状病毒感染宿主昆虫,存在初始感染和系统性感染两个阶段。在BmNPV感染家蚕过程中,病毒初始感染进入中肠和在中肠中的复制对其系统性感染至关重要。通过经口添食和皮下注射,对BmNPV感染过程中中肠和血淋巴的感染情况进行了检测。分析发现:经过荧光增白剂(FB28 0.05%)处理后,871与871C感染BmNPV相比与未经处理的对照组死亡时间提前1~2天,死亡率显著增加,表明家蚕围食膜对BmNPV的感染具有重要的防御作用;但两个品系对BmNPV的敏感性变化未出现差异,表明围食膜的屏障作用并不是影响两者抗性差异的主要因素。BmNPV经口感染后6h,对中肠中病毒DNA拷贝数和vp39表达水平检测分析发现,两者无显著差异,表明BmNPV在入侵871与871C中肠细胞过程中两者没有差异。通过检测BV粒子与两种家蚕血清温育后病毒毒力的变化,发现871与871C的血清对病毒毒力没有显著影响。皮下注射感染24h后,均能够在血细胞中观察到绿色荧光,表明BV粒子均能够进入871与871C的血淋巴细胞。通过对注射感染后血细胞中病毒DNA拷贝数与病毒vp39表达水平的检测,在感染3h病毒DNA拷贝数与vp39表达量基本一致,表明病毒粒子进入血细胞没有差异。综合871与871C中肠细胞和血细胞中BmNPV的DNA复制水平和基因表达水平分析结果,表明BmNPV在感染过程中均能够入侵两者细胞内,但随后BmNPV在受感染的细胞中的增殖出现了差异,暗示着抗性品系871C存在胞内抑制病毒的复制和增殖机制。4.BmNPV增殖被阻断时期的分析通过收集皮下注射后的两种家蚕品系的血细胞在BmNPV感染后3h、6h、12h、24h和48h的RNA,反转录分别获得c DNA文库,基于BmNPV的立即早期基因ie-1、早期基因gp64、晚期基因vp39和lef-3、以及极晚期基因p10表达时序性,通过q RT-PCR分析BmNPV在宿主细胞内的基因表达过程。结果表明,两种家蚕中感染后3 h和6 h及以内ie-1,gp64,vp39均能够低量表达,且两者没有明显差异。说明病毒在感染初期并没有受到抗性机制的影响;在感染12 h及以后这些基因在两种差异品系中表达水平出现显著差异,且随后在871C中下调表达。同时检测了ie-1、vp39和p10在两种家蚕品系脂肪体和中肠表达情况,结果与血细胞中的一致。以上结果显示BmNPV在感染早期被抑制,表明871C存在某种抗病毒机制抑制了病毒部分早期基因的表达,从而导致了病毒的复制增殖被阻断。5.转录组学分析两品系的差异基因为了进一步解析该差异机制,选取两品系未感染及感染后12h、24h、48h的家蚕中肠,构建8个转录组文库进行比较转录组学分析,得到1031差异表达基因。其中BmNPV感染分别引起敏感品系871和抗性品系871C中749个和381个基因发生显著变化。GO分析分析这些差异基因主要集中在代谢、催化活性、细胞进程、结合、细胞组分等,KEGG分析显示,这些差异基因主要参与能量代谢、氨基酸的代谢、糖类代谢、次级产物代谢等。同时我们观察到BmNPV对871的影响大于871C,暗示了BmNPV可能劫持了宿主细胞基本代谢通路用于自身复制增殖。不同品系间差异基因共有773个,抗性家蚕品系871C在模式识别、免疫通路、细胞凋亡、效应分子等多种抗病毒通路基因表达均高于敏感品系871。通过对差异基因分析,发现差异基因BGIBMGA003660基因不仅在871C中高表达,其表达水平是871的5.25倍,同时在BmNPV感染家蚕后该基因也上调表达,且该基因与其他昆虫C-type Lectin(具有抗感染等免疫功能)具有很高的同源性,暗示该基因可能具有抑制BmNPV增殖的作用,因此我们将BGIBMGA003660基因作为候选基因进行深入研究。6.BmCTL-S5基因的克隆表达及抗病毒功能分析为了鉴定候选基因(BGIBMGA003660)在BmNPV复制增殖中的功能特征,本研究成功克隆了BGIBMGA003660(Bm CLT-S5)基因并对该基因进行了生物信息学分析,结果显示该蛋白包含一个EPQ(Glu-Pro-Gln)保守基序和CRD保守结构域,其N-端含有21aa的信号肽。对该蛋白进行亚细胞定位分析结果表明,Bm CLTS5蛋白均匀的分布于细胞质中。RT-PCR分析显示Bm CLT-S5在抗性品系(871C)中表达显著高于敏感品系(871),BmNPV感染后该基因上调表达,且871C表达水平显著高于871。过表达pi ZBm CTL-S5Flag结果显示过表达的细胞中没有检测病毒的荧光信号,能够明显抑制BmNPV增殖复制;进而筛选该基因过表达的稳定细胞系感染BmNPV后,发现该基因能够在基因表达水平,DNA复制水平和病毒增殖水平有效抑制病毒增殖。瞬时转染Bm CLT-S5的Cas-9敲除载体Cas9-CTL,结果表明敲除载体能够显著编辑Bm CLT-S5基因,敲除该基因能够明显促进病毒复制增殖。以上结果表明Bm CLT-S5具有显著抑制BmNPV复制增殖的能力。