【摘 要】
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目的:基于网络药理学研究银杏叶提取物防治老年性聋的的潜在靶点通路,并通过基础实验探讨银杏叶提取物对老年性聋大鼠模型的听功能、耳蜗组织形态学和自噬相关蛋白表达的影响。方法:1.运用中药系统药理学分析平台（TCMSP）筛选银杏叶的有效成分,Gene Cards数据库获得老年性聋相关靶点基因,微生信对基因本体论（GO）、基因组百科全书（KEGG）进行功能富集。2.将45只SD大鼠随机分为5组（n=9）:
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目的:基于网络药理学研究银杏叶提取物防治老年性聋的的潜在靶点通路,并通过基础实验探讨银杏叶提取物对老年性聋大鼠模型的听功能、耳蜗组织形态学和自噬相关蛋白表达的影响。方法:1.运用中药系统药理学分析平台（TCMSP）筛选银杏叶的有效成分,Gene Cards数据库获得老年性聋相关靶点基因,微生信对基因本体论（GO）、基因组百科全书（KEGG）进行功能富集。2.将45只SD大鼠随机分为5组（n=9）:对照组、模型组、银杏叶提取物低、中及高剂量组,采用D-半乳糖诱导大鼠制备老年性聋的动物模型,造模成功后腹腔注射低、中、高剂量(10、20、30mg·kg-1)的银杏叶提取物。3.治疗前后分别采用听性脑干诱发电位（ABR）检测大鼠听阈的变化。4.运用HE染色法观察各组大鼠耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞和血管纹形态及数量的变化。5.运用免疫荧光染色耳蜗基底膜铺片观察内外毛细胞形态及数量变化。6.酶联免疫吸附实验（Elisa）检测血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）含量变化。7.透射电子显微镜观察毛细胞超微结构及自噬小体变化。8.免疫组化检测耳蜗毛细胞Beclin1蛋白表达。9.免疫印迹法检测耳蜗组织中自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3Ⅱ及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值表达水平。结果:1.筛选出银杏叶有效成分27种,与老年性聋相关的靶点基因1358个,GO富集主要涉及细胞衰老、过氧化物酶成分、氧化还原酶的活性等;KEGG富集相关性较高的通路包括细胞自噬通路和氧化应激相关的谷胱甘肽代谢通路。2.ABR阈值:治疗前,与对照组相比,其余四组的ABR阈值显著升高（P＜0.01）。治疗后,与模型组相比,银杏叶提取物低、中、高剂量组ABR阈值明显降低（P＜0.05）,且高剂量组在低频（4、8 k Hz）改善最佳（P＜0.001）。3.耳蜗组织HE染色:对照组毛细胞、血管纹、螺旋神经节细胞等形态均正常。与对照组相比,模型组毛细胞和螺旋神经节细胞明显丢失,血管纹厚度显萎缩,差异具有统计学意义（P＜0.01）。经过银杏叶提取物治疗后发现,毛细胞、螺旋神经节细胞形态明显改善,数量逐渐增多,血管纹厚度增加（P＜0.01）。4.免疫荧光染色耳蜗基底膜铺片:对照组内、外毛细胞排列整齐,结构规整;模型组大量内、外毛细胞形态变性、结构紊乱;与模型组比较,治疗后,银杏叶提取物高、中、低剂量组内、外毛细胞的存活数均提高,差异具有统计学意义（P＜0.05）,且三个治疗组内、外毛细胞形态均有所改善,低剂量组外毛细胞形态改善不如中、高剂量组。5.酶联免疫吸附试验:治疗前,与对照组相比,其余各组血清T-SOD含量显著降低（P＜0.01）,而MDA含量明显升高（P＜0.01）,表明造模成功;治疗后,与模型组比较,EGB低、中剂量组T-SOD含量差异无统计学意义（P＞0.05）,高剂量组T-SOD含量显著升高（P＜0.01）,与模型组比较,EGB低剂量组MDA含量差异无统计学意义（P＞0.05）,而中、高剂量组MDA含量显著下调（P＜0.01）。6.透射电子显微镜观察各组耳蜗毛细胞超微结构:对照组大鼠耳蜗毛细胞的超微结构正常,自噬小体数量较多。模型组毛细胞超微结构严重破坏,自噬小体数量显著降低（P＜0.01）。银杏叶提取物治疗后,与模型组比较,低剂量组变化不明显,中、高剂量组毛细胞超微结构逐渐改善,自噬小体数量逐渐增多（P＜0.05）。7.免疫组化:Beclin1蛋白在对照组毛细胞的胞浆中表达较强。与对照组相比,模型组Beclin1蛋白表达显著降低;与模型组比较,银杏叶提取物各治疗组Beclin1蛋白表达呈剂量依赖性上调。8.免疫印迹:与对照组相比,模型组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值表达水平明显均降低,P62蛋白表达水平显著提高（P＜0.01）;与模型组相比,银杏叶提取物各组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值表达水平均提高（P＜0.05）,P62蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）,差异具有统计学意义。结论:1.银杏叶提取物能改善老年性聋大鼠的听功能。2.银杏叶提取物能延缓老年性聋大鼠的耳蜗组织毛细胞、螺旋神经节细胞、血管纹等的损伤。3.银杏叶提取物能增加血清中T-SOD含量,降低MDA含量,进而减轻老年性聋大鼠氧化应激损伤。4.银杏叶提取物可能是通过调控耳蜗组织中自噬相关因子Beclin1、LC3Ⅱ和p62的表达,促进自噬小体形成,提高自噬功能来延缓老年性聋的进程。
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