【摘 要】
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落叶松是我国重要的针叶用材树种之一,利用分子育种手段对落叶松进行遗传改良,建立高效的人工林对落叶松产业的发展具有重要的意义。但目前落叶松的遗传转化技术仍然存在着不统一,稳定性差的问题,这主要是由落叶松易转化细胞系的缺乏,受体材料选择压使用不明确及转化条件没有标准化等因素造成。本研究以落叶松干细胞为材料,基于落叶松体细胞胚胎发生技术和农杆菌介导法,探究落叶松遗传转化过程中的影响因子,建立落叶松转基因
【基金项目】
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转基因生物新品种培育重大专项项目“转基因落叶松新品种培育及产业化研究(2018ZX08020-003)”; “国家自然基金重点项目”“落叶松速生、抗逆基因工程育种研究(2013AA102704-03)”国家高技术研究发展计划(863计划)课题“白桦、落叶松转基因育种研究”(2013AA102704);
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落叶松是我国重要的针叶用材树种之一,利用分子育种手段对落叶松进行遗传改良,建立高效的人工林对落叶松产业的发展具有重要的意义。但目前落叶松的遗传转化技术仍然存在着不统一,稳定性差的问题,这主要是由落叶松易转化细胞系的缺乏,受体材料选择压使用不明确及转化条件没有标准化等因素造成。本研究以落叶松干细胞为材料,基于落叶松体细胞胚胎发生技术和农杆菌介导法,探究落叶松遗传转化过程中的影响因子,建立落叶松转基因标准化平台,提高落叶松遗传转化的效率和稳定性,并在此基础上筛选具有调控落叶松生长发育潜能的MADS-box基因,进行转化验证,为利用基因工程育种创制新种质对落叶松进行遗传改良提供良好的平台。主要研究结果如下:(1)利用不同浓度的Hyg(Hygromycin B)、Cef(Cefotaxime)对落叶松胚性细胞系进行抗生素选择压的筛选,结果显示:Hyg能显著抑制落叶松胚性细胞的生长,当Hyg浓度为3 mg/L时,细胞系X228已基本不再增殖;当Hyg浓度为5 mg/L时,细胞系X31和X268不能再进行增殖。最适合落叶松胚性细胞生长的Cef的浓度为300-500 mg/L,在此Cef浓度下,落叶松胚性细胞的增殖速率加快。(2)通过对9个不同基因型的落叶松胚性细胞系进行增殖能力、成熟体细胞胚诱导率、生根率及转化率的筛选,结果表明,细胞系X31、X228、X268具有较强的再生能力和较高的转化率,符合落叶松易转化细胞系的要求,适宜作为遗传转化的受体材料。(3)通过设置农杆菌浓度为OD600=0.1、0.3、0.5、0.7,侵染时间为10 min、20 min、30 min,共培养时间为1 d、2 d、3 d,和Cef的浓度为300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L,恢复培养的时间为5 d、7 d、9 d进行落叶松遗传转化条件的优化来探索遗传转化的标准条件,结果表明,当农杆菌的浓度为OD600=0.1,侵染时间为10 min,且共培养48 h时,具有最高的转化率;Cef的最适脱菌浓度为400 mg/L,恢复培养的最佳时间为7 d,基于此转化条件我们的转化率达到2.0个/g。(4)对实验室之前得到的27个转录本进行生物信息学分析和基因克隆,共得到20个转录因子,其中多数属于MADS-box家族。GO注释分析表明,它们大部分与植物的生殖发育相关,q RT-PCR的结果显示,LaAGL2-1、LaAGL2-2、LaAGL2-3、LaSOC1-1、LaAGL11、LaAP2-2的表达模式呈现出年龄依赖性,且在无性繁殖过程中表达模式发生了改变,在落叶松从幼年生长阶段向成年生殖生长阶段的转变中发挥着调控作用,具有促进落叶松速生的潜能。进一步利用本文建立的落叶松转基因标准化平台对这些基因进行遗传转化,成功获得了转基因阳性细胞系,证明了落叶松转基因标准化平台的稳定性。综上所述,我们建立了落叶松转基因标准化平台,提高了落叶松遗传转化的效率和稳定性,筛选出了具有速生潜力的目标基因,为利用遗传转化创制落叶松新种质提供了一个高效、稳定的体系。
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