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环氧合酶2（Cyclooxygenase-2,COX-2）作为前列腺素内过氧化物酶COX的同工酶之一,可以快速应答一系列促炎介质和细胞因子,介导炎症的产生。根据相关报道,在心肌缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion,I/R）损伤发生发展的过程中,COX-2参与了心肌I/R损伤的病理炎症发展过程,在心肌损伤的病理过程中扮演重要角色。JunB,是转录因子激活蛋白-1（Activating Protein-1,AP-1）家族中的一员。AP-1作为转录调控因子,其主要包括Jun和Fos两大家族。JunB作用非常广泛,包括促胚胎发育、促细胞分化与增殖、参与炎症反应、参与氧化应激反应等。根据相关报道,在心肌I/R损伤或细胞缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）情况下JunB表达升高,与炎症因子增高和继发炎症反应密切相关。钙通道阻滞剂（Calcium Channel Blockers,CCB）主要通过阻断细胞膜上的L-型电压依赖性钙离子通道（L-Type Voltage-Dependent Calcium Channel,L-VDCC）来发挥其药物作用。一般按化学结构分为以下三类:以硝苯地平（Nifedipine,Nif）为代表药物的二氢吡啶类（DHPs）,;以地尔硫（?）（Diltiazem,Dil）为代表药物的苯并硫氮杂（?）类（BTZs）;以维拉帕米（Verapamil,Ver）为代表药物的苯烷胺类（PAAs）。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide,F2）是课题组合成的一种具有心血管活性的CCB。传统观点认为,CCB作用于心肌和血管平滑肌细胞膜上的L-VDCC发挥保护作用,但近年来亦有研究认为CCB存在非L-VDCC依赖地发挥心脏保护作用,本实验室前期研究表明,在敲除L-VDCC通道（Cacnal C-/-）的H9c2细胞上建立H/R模型实验,CCB通过非L-VDCC阻断作用拮抗H/R损伤,其机制可能与调节COX-2和JunB有关,证明了 CCB对心肌I/R损伤可能具有非L-VDCC依赖的保护机制。为了更准确、全面说明上述问题,本研究采用心肌缺血再灌注损伤最先受累的大鼠心脏微血管内皮细胞（Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs）,观察CCB对细胞H/R损伤的作用,我们以COX-2和JunB为靶点,探讨CCB通过对上述两个基因的调控拮抗细胞H/R损伤,因为CMECs无L-VDCC,故CCB改善CMECs H/R损伤作用与L-VDCC无关。方法:1.建立CMECs细胞H/R模型,通过检测H/R后COX-2和JunB的蛋白表达和乳酸脱氢酶（LDH）的漏出程度,确定COX-2和JunB在H/R损伤中的模型时间点。2.采用COX-2-siRNA转染以及COX-2特异性抑制剂NS398的方法分别干扰和抑制COX-2的表达及其活性,检测LDH、SOD、MDA、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1）、细胞凋亡、产物以及活性的情况,探索COX-2与H/R之间的关系。3.采用JunB-siRNA转染方法干扰JunB的表达,分别检测LDH、SOD、MDA、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α和ICAM-1）以及细胞凋亡的情况,探索JunB与H/R之间的关系。4.给予不同浓度（10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L）的 CCB（Ver、Nif、Dil 和 F2）,检测CMECs上COX-2和JunB的蛋白表达及相关指标,观察药物效果。结果:第一部分 CCB调控COX-2拮抗CMECs H/R损伤1.与Ctrl组作比较,缺氧3 h时,COX-2的蛋白表达最高（p<0.05）;与Ctrl组作比较,CMECs缺氧3h/复氧2小时（H3h/R2h）时,COX-2的蛋白高表达,LDH漏出量增加（p<0.05）,故选用H3h/R2 h作为H/R损伤模型的时间点。2.与Ctrl组作比较,H/R组LDH漏出增加,MDA浓度升高,TNF-α、IL-1β、IL-6以及ICAM-1产生增多,细胞凋亡加重,SOD活性降低,COX-2活性增加,其产物PGE2和PGI2的产生增加（p<0.05）。采用COX-2特异性抑制剂NS398抑制COX-2活性后,与溶剂组H/R+DMSO作比较,H/R+NS398组LDH漏出减少,MDA浓度减少,TNF-α、IL-1β、IL-6以及ICAM-1产生变少、细胞凋亡改善,SOD活性升高,COX-2活性降低,其产物PGE2和PGl2的产生降低（p<0.05）。3.与Ctrl组作比较,H/R组LDH漏出增加,MDA浓度升高,TNF-α、IL-1β、IL-6以及ICAM-1产生增多,细胞凋亡加重,SOD活性降低（p<0.05）。与H/R+NC作比较,H/R+COX-2-siRNA 组 LDH 漏出减少,MDA 浓度减少,TNF-α、IL-1β、IL-6 以及 ICAM-1产生变少、细胞凋亡改善,SOD活性升高（p<0.05）。4.分别给予不同浓度（10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L）的 Ver、Nif、Dil 和 F2 后,Nif和Dil能有效降低地H/R后COX-2的蛋白表达,使LDH漏出减少,MDA浓度减少,TNF-α、IL-1β、IL-6以及ICAM-1产生变少、细胞凋亡改善,SOD活性升高（p<0.05）,而且Nif和Dil能剂量依赖性地降低COX-2活性,减少其产物PGE2的产生（p<0.05）。第二部分 CCB调控JunB拮抗CMECs H/R损伤1.与Ctrl组作比较,缺氧3h时,JunB的蛋白表达最高（p<0.05）,与Ctrl组比,CMECs缺氧3h/复氧2小时（H3h/R2h）时,JunB的蛋白高表达,LDH漏出量增加（p<0.05）,故选用H3h/R2 h作为H/R损伤模型的时间点。2.与Ctrl组作比较,H/R组LDH漏出增加、MDA浓度升高、TNF-α,IL-1β,IL-6产生增多、细胞凋亡加重、SOD活性降低。与H/R+NC作比较,H/R+JunB si-RNA组LDH漏出减少,MDA浓度减少,TNF-α、IL-1β、IL-6以及ICAM-1产生变少、细胞凋亡改善,SOD活性升高（p<0.05）。3.分别给予不同浓度（10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L）的 Ver、Nif、Dil 和 F2 后,Nif能呈剂量依赖性地降低了 H/R后JunB的蛋白表达,使LDH漏出减少,MDA浓度减少,TNF-α、IL-1β、IL-6以及ICAM-1产生变少、细胞凋亡改善,SOD活性升高（p<0.05）。结论:1.COX-2和JunB在CMECs中参与H/R损伤的发生发展。2.Nif、Dil通过调节COX-2拮抗CMECs H/R损伤。3.Nif通过调节JunB拮抗CMECs H/R损伤。4.在CMECs中CCB可能通过非L-VDCC依赖的途径调节COX-2和JunB拮抗H/R损伤。