食管鳞癌(esophageal squamous epithelial carcinoma,ESEC)是发生在食管鳞状上皮组织的恶性肿瘤。我国是食管癌的高发国家之一。癌细胞的特征为具有抵抗低氧、化学药物以及辐射等伤害而呈现失调的异常增殖能力,Cyclin D1高表达,与增殖密切相关的PI3k/Akt信号转导途径不能被失活的PTEN抑癌基因所抑制。食管癌细胞过高表达的c-met,VEGF恶性标志等。皂甙(Saponins)又名皂苷或皂素,是固醇或三萜类化合物的低聚配糖体的总称,其广泛存在于植物界及海洋生物中。大豆皂甙(Soyasaponin)属五环三萜类皂甙,主要分为大豆皂甙A和大豆皂甙B,尤其是大豆皂甙B浓缩提取物的效应强于大豆皂甙A。近年来,国内外研究结果显示,大豆皂甙对机体有抗氧化、清除体内自由基、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒作用,抑制恶性肿瘤生长等多方面药理效应。大豆皂甙Bb作为大豆皂甙B的主要成分对癌细胞的作用已有报道,但很少涉及机理的探讨。槲皮素(1,3,4,5,7-五羟基黄酮,Quercetin)是自然界分布最广最有效的生物类黄酮化合物,广泛存在于蔬菜和水果中,同时它也是多种中草药的成分。槲皮素具有抗氧化、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗炎、抗过敏、抗病毒等多种生物学活性,有些机理已见报道,但关于纳米脂质体槲皮素抗癌机理方面少有报道。以往抑癌药物,包括槲皮素的效应多是关于下调癌基因,上调抑癌基因和抑制转移基因以及诱导凋亡相关基因的表达等报道。近年学者们注意到肿瘤细胞除去由于有关基因的突变导致其功能改变以外,尚有核内染色质表基因(epigenetic)的修饰,如组蛋白的甲基化,乙酰化等。此种胞核的修饰可影响或改变一系列细胞过程,如分化、增殖、生存或凋亡等。本实验以水溶性的大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素诱导食管癌细胞后,探讨大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素是否可作为组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制药物对食管癌细胞呈逆转化和凋亡效应及其机制。目的探讨大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素诱导人食管癌细胞逆转化和凋亡的效应及其机理。方法1.药物制备:纳米脂质体槲皮素制备:以一定比例的类脂和槲皮素溶于氯仿和DMSO后,采用真空旋转蒸发法,超声破碎仪破碎,最后通过80nm的滤膜过滤,即nLQ;大豆皂甙Bb(Soyasaponin Bb,SSBb),提取物购自上海同田生物公司。2.MTT实验检测细胞生长抑制率:检测不同浓度大豆皂甙Bb对ECa-9706细胞的生长的影响,实验分为四组,对照(C)组和大豆皂甙Bb(SSBb)组浓度分别为26.5μmol/L,106μmol/L,424μmol/L,对照(C)组不72h后检测各组OD值,并检测各组的细胞生长抑制率;检测大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素对ECa-9706细胞的生长抑制率,实验分为三组:(1)大豆皂甙Bb组(SSBb组):用106μmol/L的SSBb处理ECa-9706细胞48h;(2)纳米脂质体槲皮素组(nLQ组):用40μmol/L纳米脂质体槲皮素处理ECa-9706细胞48h;(3)对照(C)组:不加药物培养48h。3.细胞凋亡检测:实验分为三组,对照(C)组,大豆皂甙Bb(SSBb)组浓度为106μmol/L,纳米脂质体槲皮素组浓度为40μmol/L,对照(C)组为不加药物培养。用4%多聚甲醛固定三组细胞标本,然后用5g/ml蛋白酶K37℃消化5min:再用4%多聚甲醛后固定5min,之后各标本加TdT孵育液15μl,4℃过夜。先用pH7.5的Tris-Cl 1:100稀释碱性磷酸酶标记的链霉亲和素(SA-AP),37℃孵育20min,再用NBT/BCIP显色,37℃孵育30min,镜下观察,水洗终止反应。同时进行以PBS代替TdT孵育液的阴性对照。4.免疫组织化学染色:用106μmol/L SSBb和40μmol/L纳米脂质体槲皮素处理ECa-9706细胞48h后,用4%多聚甲醛固定的细胞滴片,应用SP试剂盒,检测c-met,VEGF,HDAC1,PTEN,caspase3,NF-kB及Cyclin D1的表达及定位。同时设以PBS代替一抗的空白对照。加药物培养。分别培养24h,48h,5.免疫印迹:用106μmol/L的SSBb和40μmol/LnLQ处理ECa-9706细胞48h后,以Trizol试剂提取其总蛋白质,检测蛋白质浓度后进行SDS-PAGE电泳。将SDS-PAGE电泳胶转于硝酸纤维素膜(NCM)上,对c-met,VEGF,Cyclin D1、NF-kB和PTEN(以β-actin作为内参照)进行免疫印迹定性及半定量检测。6.统计学分析:应用图像分析仪扫描免疫印迹信号和免疫细胞化学染色标本的灰度均值。采用SPSS12.0软件进行统计学分析,服从正态分布的数据以均数±标准差((?)±s)表示,不同处理组间均数的比较采用单因素方差分析,结果判定以α=0.05为显著水平。结果1.MTT检测:结果表明,与对照组细胞相比,SSBb组和nLQ组对Eca-9706细胞生长抑制率(suppressing rate,SR)差异有统计学意义,P＜0.05,但nLQ组和SSBb组间未见差异,P＞0.05。2.凋亡率:在人食管癌Eca-9706细胞中,TUNEL的凋亡信号呈蓝紫色,凋亡的细胞中胞核或固缩,或呈新月状位于细胞周围,部分细胞可见凋亡小体。C组,nLQ组和SSBb组凋亡率分别为5.0%,42%和40%。与对照组细胞凋亡率相比,nLQ组和SSBb组细胞的凋亡率差异有统计学意义,P＜0.01。3.免疫组化结果:人食管癌ECa-9706细胞中c-met,VEGF,HDAC1,PTEN,caspase-3,NF-kB及Cyclin D1的免疫反应性(immunoreactivity,IR)呈棕色细颗粒。激活的Cyclin D1,NF-kB,HDAC1、caspase-3及PTEN的IR信号主要分布于胞核,c-met-IR及VEGF-IR分布于胞质/胞核。与对照组相比,nLQ组和SSBb组食管癌细胞的caspase 3和PTEN的IR信号增强,Cyclin D1,c-met,VEGF,NF-kB,HDAC1的IR信号减弱,差异有统计学意义,P＜0.01。4.免疫印迹结果:与对照组相比,大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素组增强了PTEN和caspase-3的印迹信号;使HDAC1,NF-kB,Cyclin D1,c-met和VEGF的印迹信号减弱,P＜0.01.免疫组化和免疫印迹信号之间呈正相关,r=0.87～0.94,P＜0.05。结论1.大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素对ECa-9706细胞生长有抑制作用,但两组之间无统计学差异。2.大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素皆降低ECa-9706细胞c-met及VEGF的过高表达。3.大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素可诱导人食管癌细胞的凋亡,凋亡率分别为40%和42%。4.大豆皂甙Bb和纳米脂质体槲皮素诱导人食管癌细胞凋亡主要为通过抑制HDAC1-NF-kB,激活PTEN和caspase-3途径而诱导细胞凋亡。