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目的:通过在体外建立骨性关节炎软骨细胞凋亡模型,探讨姜黄素通过Sirt1/FoxO1信号通路对软骨细胞凋亡的调控作用。方法:二步法提取新西兰大白兔膝关节软骨细胞;以甲苯胺蓝染色法等鉴定细胞;设置浓度梯度分组,通过CCK-8、流式细胞仪检测方法,筛选硝普纳造模浓度和姜黄素干预的最适药物浓度;设置CON组、SNP组、SNP+CUR组和SNP+CUR+NAM组,加入SNP、CUR以及NAM药物处理后,通过Real-time PCR、Western Blot方法检测筛选姜黄素对于Sirt1/FoxO1信号通路的调控作用,验证Sirt1与FoxO1在软骨细胞的相互作用关系;通过JC-1试剂盒检测法、流式细胞仪检测法及Western Blot法,检测姜黄素通过Sirt1/FoxO1信号通路对软骨细凋亡的调控作用。结果:1.软骨细胞提取鉴定（1）二步法消化提取软骨细胞:观察不同时间段原代软骨细胞的增殖情况,可见初始提取的软骨细胞成单个游离悬浮状态细胞透亮,分层分布;12小时后逐渐贴壁,呈均匀单层分布;24小时开始逐渐生长出伪足,48小时开始出现多细胞集落生长现象。（2）软骨细胞鉴定:甲苯胺蓝染色:可见软骨细胞胞核呈蓝紫色深染,核仁紫红色,胞质淡蓝,胞质内及细胞外可见少量蓝紫色异染颗粒;阿利新蓝染色:可见细胞核深蓝绿染色,胞质蓝绿色淡染,背景整体呈浅蓝绿色;免疫荧光染色:可见Ⅱ-型胶原蛋白呈深红色颗粒状均匀分布于软骨细胞胞质内,DAPI染色后细胞核呈染淡蓝色,细胞核Ⅱ-型胶原蛋白染色较少。2.药物浓度筛选（1）流式细胞仪检测SNP最适浓度:随着SNP浓度增高,细胞逐渐出现从早期凋亡到晚期凋亡增加的趋势,并最终出现坏死;SNP在0.5mmol/L之前,细胞主要为早中期凋亡,在SNP浓度达到1.0mmol/L之后,软骨细胞主要表现为晚期凋亡。（2）CCK-8法筛选姜黄素最适药物浓度:相对于空白对照组（NCG）,控制对照组（CG）的OD值无统计学差异;相对于CG组,姜黄素浓度梯度各组出现了不同的促进软骨细胞增值的效果,其中,在5μmol/L的时候,姜黄素促软骨增殖效果最明显;在浓度大于50μmol/L之后,姜黄素促进软骨增值的效果有所下降。3.姜黄素对Sirt1/FoxO1信号通路表达影响（1）Real-time PCR:（1）对于Sirt1:相对于CON组,SNP组的Sirt1m RNA相对表达量提高（P＜0.05）;相对于SNP组,SNP+CUR组的Sirt1m RNA相对表达量显著提高（P＜0.01）;相对于SNP+CUR组,SNP+CUR+NAM组,Sirt1m RNA表达量降低（P＜0.05）。（2）对于FoxO1:SNP组的FoxO1m RNA相对表达量明显低于CON组（P＜0.01）;相对于SNP组,SNP+CUR组的FoxO1m RNA相对表达量有所提升（P＜0.05）;相对于SNP+CUR组而言,SNP+CUR+NAM组的FoxO1m RNA表达量有所降低（P＜0.05）。（2）Western Blot:（1）对于Sirt1:相对于CON组,SNP组的Sirt1蛋白相对表达量降低（P＜0.05）;相对于SNP组,SNP+CUR组的Sirt1蛋白相对表达量显著提高（P＜0.001）;相对于SNP+CUR组,SNP+CUR+NAM组,Sirt1蛋白表达量降低（P＜0.01）。（2）对于FoxO1:SNP组的FoxO1蛋白相对表达量明显低于CON组（P＜0.01）;相对于SNP组,SNP+CUR组的FoxO1蛋白相对表达量有所提升（P＜0.01）;相对于SNP+CUR组,SNP+CUR+NAM组的FoxO1蛋白相对表达量有所降低（P＜0.05）。4.姜黄素通过Sirt1/FoxO1信号通路抗软骨细胞凋亡作用（1）JC-1试剂盒检测软骨细胞膜电位（Δψm）改变情况:CON组基本表现为红色荧光;SNP组基本表现为绿色荧光;SNP+CUR组大部分为红色荧光,少部分绿色荧光;SNP+CUR+NAM组大部分表现为绿色荧光,少部分为橙红色荧光。（2）流式细胞仪检测:相比CON组,SNP组表现明显的细胞凋亡现象（P＜0.001）;相比SNP组,SNP+CUR组凋亡率显著下降（P＜0.01）;相比SNP+CUR组,SNP+CUR+NAM组细胞凋亡率明显增高（P＜0.05）。（3）Western Blot检测:相对CON组,SNP组促凋亡因子:Caspase9、Caspase3、Bax及Cyt-C显著高于正常组（P＜0.05）,而抗凋亡因子Bcl-2低于正常组（P＜0.05）;相比SNP组,SNP+CUR组的促凋亡因子Caspase9、Caspase3、Bax及Cyt-C明显降低（P＜0.05）;相比SNP+CUR组,SNP+CUR+NAM组的促凋亡因子Caspase9、Caspase3、Bax及Cyt-C明显回升（P＜0.05）,抗凋亡因子BCl-2表达减少（P＜0.05）。结论:1.二步法可以成功提取新西兰大白兔膝关节软骨细胞;2.硝普纳体外诱导法可以成功建立细胞水平的软骨细胞凋亡模型;3.低浓度姜黄素可以促进新西兰大白兔软骨细胞的增殖;4.姜黄素可以激活Sirt1/FoxO1信号通路,且激活的Sirt1因子能够促进FoxO1的表达。5.姜黄素可以通过Sirt1/FoxO1信号通路抵抗硝普纳诱导的软骨细胞凋亡。