论文部分内容阅读
研究目的采用复合因素(肥甘饮食+外湿热环境+MHV-A59病毒感染)建立小鼠病毒性肝炎温病湿热证模型,探索新的生物感染因子和动物的温病湿热证模型；通过研究TLR2、TLR4、NF-κBP65、IL-1β、IFN-γ的表达变化,探讨温病湿热证与Toll样受体通路的相关性；运用方证相应理论,使用清热化湿类方药(蒿芩清胆汤、甘露消毒丹)干预上述靶点,分析清热祛湿法干预温病湿热证的药效机制及可能作用机理。研究方法1.4周龄SPF级BALB／c雄性小鼠72只随机分为9组,每组8只。正常组予普通饲料,同步饲养；其余8组小鼠予高脂饲料+湿热环境10天(d),第11 d不同浓度小鼠肝炎病毒(MHV-A59)0.5ml／只腹腔注射；攻毒后再连续观察8d。记录全部小鼠体重变化、皮毛、饮食及死亡情况,根据LD50变化,确定最佳攻毒剂量。2.在实验1基础上,确定最佳攻毒剂量后。4周龄SPF级BALB／c雄性小鼠40只,随机分为以下4组,每组10只。A组：正常对照组：正常饮食,同步饲养；B组：单纯湿热组：肥甘饮食+湿热环境；C组：单纯病毒组：正常饮食+小鼠肝炎病毒；D组：模型组：肥甘饮食+湿热环境+小鼠肝炎病毒；模型复制过程中,观察模型动物的症状(纳呆,便溏或便秘,倦怠),饮水量,饮食量,体重,肛温。采用全自动生化分析仪检测肝功能；HE染色观察肝组织病理变化：组织芯片及荧光定量PCR法检测肝组织TLR2、TLR4、NF-κBP65、IL-1β、IFN-γ的含量。3.4周龄SPF级BALB/c雄性小鼠80只,随机分为以下8组,每组10只。A组：正常对照组,造模方法同实验2；B组：单纯病毒组,造模方法同实验2；C组：模型组,造模方法同实验2；D组：单纯病毒蒿芩清胆汤治疗组,造模方法同单纯病毒组,但在病毒感染前一天起予以蒿芩清胆汤灌胃,每日1次给药,连续4d(药物均按传统煎法,剂量参考原方剂量并按人鼠体表面积换算)。E组：单纯病毒西药治疗组,造模方法同单纯病毒组,但在病毒感染前一天起予以易善复灌胃,每日1次给药,连续4d(药物剂量按人鼠体表面积换算)。F组：蒿芩清胆汤治疗组：造模方法同模型组,但在病毒感染前一天起予以蒿芩清胆汤灌胃,每日1次给药,连续4d(药物均按传统煎法,剂量参考原方剂量并按人鼠体表面积换算)。G组：甘露消毒丹治疗组：造模方法同模型组,但在病毒感染前一天起予以甘露消毒丹灌胃,每日1次给药,连续4d(药物均按传统煎法,剂量参考原方剂量并按人鼠体表面积换算)。H组：西药组：造模方法同模型组,但在病毒感染前一天起予以易善复灌胃,每日1次给药,连续4d(药物剂量按人鼠体表面积换算)。模型复制过程中,观察模型动物的症状(纳呆,便溏或便秘,倦怠),饮水量,饮食量,体重。采用全自动生化仪检测各组小鼠的肝功能,HE染色观察各组小鼠肝组织病理变化,免疫组化法检测各组小鼠肝脏TLR2、TLR4、NF-κBP65、IL-1β、IFN-γ阳性表达,荧光定量PCR检测各组小鼠肝组织中TLR2、TLR4、NF-κBP65的mRNA含量。研究结果1.实验一正常组小鼠活动、饮食、大便及精神状态均正常；各模型组小鼠可见耸毛现象,食量减少,活动减少,喜倦缩,大便溏稀符合湿热证改变特点。各模型组小鼠予以不同浓度MHV-A59病毒0.5ml／只腹腔注射后,自第4天起,开始出现小鼠死亡现象,第5天达到高峰,出现暴发型死亡；而未予攻毒的正常组无一例死亡,确定最佳攻毒剂量为10-2,即1：102的浓度腹腔注射感染小鼠,每只0.5ml。最佳观察时间为攻毒后3天内。2.实验二温病湿热证的本质中,“湿”性致病因子包括肥甘厚味和外湿环境；“热”性致病因子主要和复合因素造成的内毒素血症有关,TLR2、TLR4以及Toll-NF-κB信号通路激活,以及下游炎性细胞因子如IL-1β等大量分泌为特征。3.实验三3.1正常组小鼠体重呈自然增长趋势,大便正常,皮毛有光泽,精神状况好；其余各组小鼠体重亦增长趋势,大便偏稀,肛门污秽。经重复测量方差分析,各组小鼠体重变化无差异(P>0.05)；各组小鼠肝脏指数无统计学差异(P>0.05)。模型组及治疗组血清ALT、AST存在不同程度的升高,表明小鼠肝细胞存在不同程度坏死现象。G组血清ALT、AST与模型组(B、C组)及治疗组(D、E、F、H组)比较,有统计学意义(P<0.05)。模型组及治疗组小鼠肝脏TLR2、TLR4阳性细胞分布面积呈上升趋势,与A组比较,有统计学意义(P<0.05)。F组和G组与B组、C组、D组、E组、H组比较有统计学意义(P<0.05),经予清热化湿法治疗后,TLR2、TLR4阳性细胞表达呈下降趋势。3.2模型组及治疗各组NF-κBP 65mRNA及其蛋白表达之间比较,无统计学意义；与A组比较,有统计学意义(P<0.05)。3.3模型组及治疗各组IL-1β、IFN-γ的表达均呈上升趋势,以IL-1β变化明显,与A组比较,有统计学意义(P<0.05)；而IFN-γ变化与A组比较,无统计学意义(P>0.05)。研究结论1、在本研究模型构建中,病毒感染是造成模型小鼠病理变化的主要因素,饮食因素+气候环境因素+MHV-A59病毒感染的综合因素实验方法造模,所复制的模型较为理想,无论从发病条件,病变脏腑,还是主要症状体征均近似于中医温病湿热证型,且具有操作简单,重复性好的特点。2、本实验研究证明,小鼠病毒性肝炎湿热证以TLR2、TLR4以及Toll-NF-κB信号通路激活,NF-κBP65及下游炎性细胞因子如IL-1β等大量分泌为特征。TLR-2、TLR-4、IL-1β可以作为温病湿热证辨证的客观指标之一,是病证结合模型的深入探索。3.研究表明,清热化湿法对于小鼠病毒性肝炎湿热证有一定治疗效应,均能降低湿热证小鼠体温,增加小鼠耗食量、饮水量,改善肝功能,对内毒素受体TLR-2、TLR-4有抑制作用。清热化湿法可能通过影响TLR-2、TLR-4表达发挥改善温病湿热证的效应。4.清热化湿法对小鼠病毒性肝炎湿热证的NF-κBP65、IL-1β及IFN-γ的肝脏表达无显著改善作用。这表明蒿芩清胆汤或甘露消毒丹可能不是通过影响NF-κBP65、IL-1β及IFN-γ的表达而发挥对温病湿热证小鼠的治疗效应。