人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PSCs）的出现提供了一种可再生的细胞来源。从多能干细胞诱导的神经干细胞,可用于神经系统退行性和损伤性疾病的细胞治疗,但传统的贴壁培养无法满足细胞治疗的需求。我们先前利用小分子和生长因子的组合,确定了一种可以将人多能干细胞快速转化成神经上皮干细胞（neuroepithelial stem cells,NESCs）的诱导体系。在此基础上,本研究建立了一种稳定、可重复的悬浮培养体系,大规模培养从人ESCs诱导而来的NESCs,可用于细胞治疗、疾病建模和药物筛选。我们首先在低吸附培养皿中优化NESCs培养基,比较了优化前和优化后培养体系中NESC-spheres的质量,结果显示优化后的培养体系更适合NESCs的悬浮培养。随后我们将该体系从培养皿扩大到搅拌生物反应器中大规模培养NESCspheres,在60rpm的速率下,细胞维持稳定的自我更新。通过转录组RNA-seq和单细胞RNA-seq结果表明,NESC-spheres能够长期稳定维持其特性,具有较高的纯度和均质性。因此,本研究建立的无血清、成分简单、成本更低的悬浮培养体系可用于NESCs的大规模培养,在该体系中培养的NESC-spheres具有以下特点:球体大小均匀,细胞活率高（>95%）,增殖能力强;长期扩增后仍然具有较高的纯度和均质性,具有正常的二倍体核型;能保持稳定的自我更新能力并维持其NESCs的特性,具有自我重组形成类神经管结构的能力。大脑皮层发育异常或受损都有可能导致神经系统疾病的发生,皮层一旦受损很难再生新的神经元。为了验证NESC-spheres分化成皮层神经元的能力,我们撤除培养基中的生长因子和小分子诱导其自发分化。研究结果表明,NESCspheres具有很强的分化潜能,90%以上的细胞可分化成神经元,而且长期悬浮扩增培养并不影响其分化产生皮层神经元的能力,能够分化为不同类型的成熟皮层神经元。外泌体具有多种生物学功能,携带核酸、蛋白质和脂质,可介导细胞间的信息交流,已被广泛地用于疾病诊断和治疗的研究。然而,外泌体的提纯需要大量的细胞,制约了外泌体的应用。由于本研究我们建立了NESCs规模化悬浮培养的体系,因此我们检测了该体系是否可以用来生产外泌体。接下来,我们采用超速离心法和尺寸排阻色谱法两种方式分离悬浮培养的NESC-spheres分泌的外泌体。结果显示,两种方法获得的外泌体都具有完整的双层磷脂膜结构,大小在40～120nm之间,表达CD63和TSG101。单颗粒纳米流式分析表明,尺寸排阻色谱法分离纯化的外泌体颗粒浓度更高。由此可见,尺寸排阻色谱法分离的外泌体纯度更高,将来可用于外泌体功能和临床转化的研究。