四川猕猴桃溃疡病菌的分离鉴定及其粗毒素的研究

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猕猴桃溃疡病是在中国、日本、新西兰、意大利等主要猕猴桃生产大国发生的一种非常严重的植物病害,该病害的病原菌可通过猕猴桃苗木、接穗等栽植材料和果实的调运远距离传播,已被列入我国林业检疫性有害生物名单。本研究在比较四川猕猴桃溃疡病不同发生区的症状的表现基础上,对其病原菌进行了分离鉴定,并从病原菌的发酵培养基中提取了对猕猴桃健康枝条有侵染作用的粗毒素,研究了粗毒素对其保护酶系的影响,取得了以下主要研究成果:1、在同一时间段观察四川五个不同地方的溃疡病发病症状,名山和苍溪的病株表现出了典型的溃疡病腐烂症状,出现锈水,流胶症状,而采自崇州、德阳和都江堰的病株,病部周围存在许多锈色小点,其皮层组织呈赤褐色,同时崇州病株的病部还存在有白色小粒状菌露。2、从来源于四川5个不同地区的猕猴桃溃疡病枝条上均分离到了与标准菌株表型特征相似的细菌,采用生理生化的方法检测,并且用通用引物对5个不同地理来源的代表性菌株进行了细菌16S rDNA片段扩增,对其序列进行BLAST同源比对后,结果显示,供试的5个菌株DY10、CZ8、MSI、CX9和DJY33的生理生化特征与Pseudomonas syringae pv. actinidiae相似,同时,它们的16S rDNA序列与NCBI网站上的PSA标准菌株(GenBank AB001439.1)的同源性达到89.00%。通过以上16S rDNA序列分析和表型特征,鉴定分离病原菌为Pseudomonas syringae pv. actinidiae。3、猕猴桃溃疡病病原菌在一定的液体培养基中可以产生对猕猴桃愈伤组织有褐化作用的粗毒素,为了得到猕猴桃溃疡病病原菌的最佳产毒条件,本实验对该病菌的产毒培养条件进行了优化,在PGY培养基、BP培养基、PDB培养基、GY培养基和PD培养基这五种液体培养基中,PDB液体培养基产毒的能力最强;同时利用DPS软件分析得出,产毒的最佳培养时间为3d;通过正交试验的方差分析表明:温度,pH值和溶氧量对该菌产生毒素的影响较大,最适产毒温度为24℃,初始pH值为5.5,瓶装量为20mL时,毒素产量最多。优化后的培养条件使供试菌株产生抗菌物质的能力大大提高,褐化指数达到90%以上。4、本实验选择四川地区具有代表性的三个猕猴桃品种——金魁(高抗)、海沃德(中抗)和秦美(感病),对其接种病原菌粗毒素,之后进行SOD、POD、PPO、 CAT、PAL等生理指标的测定,得出了不同品种对于毒素的抗性能力有着明显的差异,金魁接种毒素后,在整个发病的过程中,其SOD、POD和PPO测定值的增加幅度和速度明显高于海沃德和秦美,而这三个品种的CAT和PPL检测指标值的波动差异并不显著。
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