心力衰竭（heart failure,HF）是一种复杂的异质性临床综合征,主要是由心脏收缩和/或舒张障碍引起,导致静脉系统血液淤积,体循环灌注不足,具有很高的发病率和死亡率,已经成为日益严重的公共卫生问题。尽管广泛采用基于循证医学证据的药物治疗和介入手术治疗,但仍有大量的患者因心力衰竭而出现心室功能障碍,造成生活质量低下甚至猝死。心力衰竭病理机制复杂,其特征是心肌负性重构。在急性心肌梗死或慢性压力超负荷诱导的病理性心肌重构过程中,心肌纤维化是主要的病理事件,成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞,激活转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smad3 通路诱导分泌大量的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积,胶原纤维表达增加,心肌弹性减弱,导致心室肌顺应性降低,心脏的收缩和舒张功能减弱。此外,缺血和压力负荷应激都会诱导心肌组织氧化应激增强,诱导细胞DNA损伤甚至细胞凋亡。心脏组织除了血管、淋巴、神经末梢外,主要是由心肌细胞和成纤维细胞组成。从细胞占比上看,成年小鼠心脏中含有56%的心肌细胞、27%的成纤维细胞、10%的血管平滑肌细胞和7%的内皮细胞。然而,由于心肌细胞体积大,大约是成纤维细胞的20-25倍,所以占心脏总体积的70-85%,而心肌细胞是负责心肌收缩、舒张的功能细胞,但是哺乳动物成年后的心肌细胞基本失去增生能力,所以心肌细胞是研究心肌缺血、梗死等心脏疾病所引起的心脏损伤的焦点。我们课题组在前期研究工作中发现,通过TGFβRⅡ显性负向突变体抑制TGFβ通路,虽然可以改善慢性压力超负荷诱导的心肌纤维化,但是在术后120天检测心脏功能时发现,心脏功能障碍反而进一步加重。在心肌梗死模型中,广泛抑制TGFβ信号会导致心脏破裂而导致早期死亡,但是心肌细胞特异性破坏TGFβ受体则具有保护作用,并激活广泛的抗炎和细胞保护信号。因此完全阻断TGFβ信号通路并不能使小鼠完全获益。随后我们使用2-D电泳和蛋白质组学分析发现,在cGMP刺激下,TGFβ下游信号分子Smad3与去泛素化酶BRCA1/BRCA2的复合体36亚基（Brcc36）具有很强的结合力,Brcc36与β2-tubulin骨架蛋白共同扣押Smad3入核,拮抗TGFβ介导的促纤维化的作用。而我们在小鼠的成纤维细胞中进一步研究发现,Brcc36通过水解Smad3 K63位点连接的多聚泛素链抑制TGFβ1诱导的Smad3的磷酸化,阻止其入核参与靶基因的转录。而心脏特异性敲除Brcc36对急性心肌缺血和慢性压力负荷诱导的心肌纤维化的影响,国内外还没有报道。此外,在DNA修复过程中,BRCA1-A复合物依赖RAP80识别底物蛋白K63位点连接的多聚泛素链募集到DNA损伤部位,通过水解底物蛋白K63位点的多聚泛素链,促进DNA修复病灶的形成。当BRAC1-A复合体中Brcc36的活性位点发生死亡突变,即使其他亚基结构正常能够组装成完整的复合体,但是在电离辐射诱导DNA损伤后组蛋白γH2AX的泛素化修饰水平明显增加,抑制DNA修复。而Brcc36是该复合物发挥去泛素化酶活性的催化中心,因此,干扰心肌细胞内Brcc36蛋白的表达是否会影响缺血缺氧和压力应激诱导的心肌细胞DNA损伤修复,诱导心肌细胞凋亡,加重心肌收缩舒张功能障碍,目前国内外尚没有报道。异甘草素（Isoliquiritigenin,ISL）是一种具有抗氧化活性的类黄酮单体,在多种病理模型中研究发现它具有抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗痉挛、抗心律失常、抗炎等药理作用。而氧化应激、炎症反应和纤维化等在急性心肌梗死病理过程中扮演重要角色,我们通过本实验研究异甘草素在急性心肌梗死后的氧化应激和炎症反应病理过程中的作用及其作用机制,并初步研究了其与Brcc36表达的关系。为此,我们利用心脏特异性敲除Brcc36的小鼠,通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支（left anterior descending,LAD）构建心肌梗死模型,探讨Brcc36对急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）诱导的心肌纤维化、DNA损伤修复、细胞凋亡的影响;通过横主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）构建慢性压力超负荷模型,研究Brcc36对慢性压力过载诱导的心肌肥厚、心肌纤维化、DNA损伤修复、细胞凋亡的影响及可能的机制;通过原代培养乳大鼠心肌细胞及过表达/消减Brcc36的腺病毒,在细胞水平研究Brcc36对H2O2诱导的DNA损伤修复过程中的作用及其可能的机制。最后在整体动物水平研究异甘草素对心肌梗死诱导的心肌重构的影响及与Brcc36表达的影响。研究内容分为4部分:第一章心脏特异性敲除Brcc36加重小鼠急性心肌梗死诱导的心肌损伤目的:明确心脏特异性敲除Brcc36在小鼠AMI诱导的心肌重构和DNA损伤修复中的作用机制。方法:分析MI患者心肌组织的RNA-seq数据集,比较心肌梗死患者和非心肌梗死患者的心脏转录组,寻找与Brcc36发挥心脏保护作用相关的差异表达基因。收集心力衰竭患者的心耳组织,检测Brcc36及DNA损伤标志物γH2AX的表达。利用Cre-LoxP重组酶系统构建心脏特异性敲除Brcc36基因的小鼠（Brcc36-Ko）。通过结扎小鼠心脏左冠状动脉的前降支构建心肌梗死模型,术后7天通过超声心动图检测小鼠心脏结构和功能变化;通过TTC染色、Western blot、qRT-PCR、免疫组化、TUNEL染色等方法检测心脏特异性敲除Brcc36对急性心肌梗死诱导的心脏重构、DNA损伤的影响。结果:在MI和有复发事件的患者心肌组织转录组中Brcc36 mRNA水平降低,而Smad3、CTGF、Periostin水平升高,此外MI组DNA DSB指标H2AX、DNA损伤修复因子RAD51的mRNA水平均升高。心衰患者心肌组织中Brcc36蛋白表达明显降低,γH2AX蛋白水平明显升高。通过特异性引物进行PCR扩增,鉴定心脏特异性敲除Brcc36小鼠基因型,筛选基因阳性小鼠,并通过western blot检测心脏组织中Brcc36蛋白的表达进一步验证。与野生型小鼠（WT）相比,AMI后Brcc36-Ko小鼠的存活率明显降低;TTC染色结果显示心肌梗死面积进一步增加;超声心动图结果显示左心室射血分数、短轴缩短率明显降低,心功能不全进一步加重;HE染色结果提示心肌组织损伤加重;天狼星红染色、Masson三色法染色、免疫组化结果发现,Brcc36-Ko小鼠心脏细胞外基质沉积增加,C ollagenⅠ/Ⅲ蛋白分布增加,心肌纤维化加重;Western blot检测结果发现,心脏特异性敲除Brcc36明显增加心肌组织中p-Smad3的表达,促进TGF-β1-Smad3信号通路的激活及其下游信号分子骨膜蛋白（Periostin）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）、胶原蛋白Ⅰ（collagenI）、胶原蛋白Ⅲ（collagenⅢ）mRNA水平的表达。通过western blot、免疫组化方法检测DNA损伤标志物γH2AX表达发现,AMI后Brcc36-Ko小鼠心脏组织中γH2AX的表达明显增加,DNA损伤明显加重;同时检测DNA修复蛋白RAD51的表达发现,Brcc36-Ko小鼠心脏组织中RAD51的表达明显减少,表明DNA损伤修复能力减弱。此外,通过TUNEL染色发现,心脏特异性敲除Brcc36明显加重AMI诱导的细胞凋亡,同时通过western blot检测发现,Brcc36-Ko小鼠心脏组织中促凋亡蛋白Puma、Bax、cleaved-caspase3的表达明显增加,而促存活的蛋白Mcl-1、p-Bad的表达明显减少。结论:心力衰竭患者心肌组织中Brcc36蛋白表达明显降低,出现明显的DNA损伤。心脏特异性敲除Brcc36加重AMI诱导的心肌重构,其机制与TGF-β-Smad3信号通路的过度激活,Brcc36缺失使机体对AMI诱导的DNA损伤修复能力减弱,造成心肌细胞凋亡增加有关。第二章心脏特异性敲除Brcc36加重慢性压力超负荷诱导的心肌损伤目的:明确心脏特异性敲除Brcc36对慢性压力超负荷诱导的心肌重构和DNA损伤修复的作用机制。方法:以C57BL/6J野生型小鼠、Brcc36-Ko小鼠为研究对象,通过TAC手术构建小鼠慢性压力超负荷模型,术后12周通过超声心动图检测小鼠心脏结构和功能变化;通过WGA染色、Western blot、qRT-PCR、免疫组化、TUNEL染色等方法检测心脏特异性敲除Brcc36对慢性压力负荷诱导的心脏重构、DNA损伤的作用。结果:与野生型小鼠（WT）相比,Brcc36-Ko小鼠TAC术后心脏功能明显恶化,左心室射血分数、短轴缩短率明显降低,左心室后壁厚度明显增加,WGA染色发现心肌细胞横截面积明显增加,心肌细胞肥厚进一步加重,ANP、β-MHC mRNA水平表达明显增加,而且心脏整体外观尺寸明显增加。天狼星红、Masson三色法染色检测心肌组织中胶原纤维沉积明显增加,免疫组化结果显示,CollagenⅠ/Ⅲ蛋白的表达明显增加。Western blot检测结果发现,TAC术后Brcc36-Ko小鼠心脏组织中p-smad3的表达明显增加,且其下游信号分子CTGF、Perisotin、collagenⅠ、collagenⅢ的mRNA水平明显增加,心肌纤维化明显加重。通过western blot、免疫组化方法检测γH2AX表达发现,Brcc36-Ko小鼠心脏组织中γH2AX的表达明显增加,DNA损伤明显加重,而RAD51的表达明显减少,表明DNA损伤修复能力减弱。通过TUNEL染色发现,心脏特异性敲除Brcc36明显增加TAC诱导的细胞凋亡,同时通过western blot检测发现,Brcc36-Ko小鼠心脏组织中促凋亡蛋白Puma、cleaved-caspase3的表达明显增加,而促存活的蛋白Mcl-1、Bcl-2的表达明显减少。结论:心脏特异性敲除Brcc36加重慢性压力负荷诱导的心肌重构,其机制与TGF-β-Smad3信号通路的过度激活,Brcc36缺失使机体对TAC诱导的DNA损伤修复能力减弱,造成心肌细胞凋亡增加有关。第三章Brcc36对心肌细胞DNA损伤修复的调控作用及机制目的:明确Brcc36对H2O2诱导的心肌细胞DNA损伤修复的调控作用及机制。方法:通过原代培养乳大鼠心肌细胞（Neonatal rat cardiomyocytes,NRCM）,使用过表达/消减Brcc36腺病毒感染原代培养72小时的NRCM,构建过表达/消减Brcc36的细胞模型。采用H2O2诱导心肌细胞DNA损伤模型,通过Western blot、免疫荧光、CO-IP等方法,研究Brcc36蛋白对DNA损伤修复的调控作用及机制。结果:1:H2O2引起的氧化应激损伤可以显著增加心肌细胞中γH2AX的表达,进而招募MRE11-RAD50-NBS1（MRN）,促进共济失调-毛细血管扩张突变（ataxia-telangiectasia mutated,ATM）激酶的活化,招募修复蛋白 RAD51,启动 DNA 损伤修复过程。与空载体病毒（Ad-Null）感染的心肌细胞相比,过表达Brcc36腺病毒（Ad-Brcc36）感染的心肌细胞中增加Brcc36蛋白表达可以明显降低γH2XA表达,并招募MRN复合物,并促进ATM的激活,增加RAD51的表达,增强DNA损伤修复;与之相反,消减Brcc36腺病毒（Ad-Brcc36 shRNA）感染的心肌细胞中消减Brcc36蛋白进一步增加γH2XA表达,而减少RAD51的表达,心肌细胞DNA损伤修复能力减弱。2:通过CO-IP进一步研究发现,H2O2引起的氧化应激可以增加ATM上K63位点连接的多聚泛素链,而过表达Brcc36蛋白可以明显抑制H2O2诱导的ATM K63位点连接的多聚泛素链,而消减心肌细胞中Brcc36蛋白表达会进一步加重ATM K63位点的多聚泛素链。3:H2O2引起的氧化应激可以诱导组蛋白H2AX上K63位点连接的多聚泛素链延长,而在心肌细胞中过表达Brcc36蛋白可以及时去除组蛋白H2AX K63位点连接的多聚泛素链,终止DNA修复过程,提高修复效率,而消减Brcc36蛋白表达进一步增加H2AX K63位点连接的多聚泛素链。4:H2O2引起的氧化应激可以募集DNA 损伤检查蛋白1（Mediator Of DNA Damage Checkpoint 1,MDC1）、修复因子ATM、RAP80到DNA损伤位点的组蛋白H2AX上,促进DNA损伤修复,而过表达Brcc36蛋白可以促进MDC1、ATM、RAP80聚集到DNA损伤位点,而消减Brcc36蛋白会抑制这些修复的蛋白的募集,抑制DNA损伤修复。结论:去泛素化酶Brcc36通过降低ATM K63位点连接的多聚泛素链,促进H2O2诱导的ATM的激活,并且促进MDC1、ATM、RAP80向DNA损伤位点组蛋白H2AX上募集,增加DNA损伤修复蛋白MRN复合物、RAD51的表达,并及时去除组蛋白H2AXK63位点连接的多聚泛素链,提高DNA损伤修复的效率。第四章异甘草素对急性心肌梗死的保护作用及对Brcc36表达水平的影响目的:观察异甘草素对AMI诱导的心肌重构的作用及是否与Brcc36作用有关。方法:以C57BL/6J野生雄性小鼠（8-10周龄）为研究对象,通过结扎LAD构建AMI模型,腹腔注射不同剂量的异甘草素及Nrf2抑制剂ML385,同时设置假手术对照组。通过TTC染色、超声心动图、Western blot、qRT-PCR、免疫组化、HE染色、Masson染色、TUNEL染色等方法研究异甘草素对急性心肌梗死诱导的心肌重构的作用,初步探索异甘草素的作用是否与Brcc36表达相关。结果:与对照组相比,异甘草素可以明显减小AMI模型小鼠的心肌梗死面积;超声心动图结果显示,异甘草素明显改善AMI诱导的心脏功能不全;Western blot检测发现异甘草素可以增加Brcc36蛋白的表达。此外,异甘草素通过调控Nrf2的入核,促进下游抗氧化应激蛋白HO-1的表达,减少MDA的生成,减缓抗氧化剂SOD、GSH-Px的消耗,减轻AMI诱导的氧化应激。异甘草素通过抑制NF-κB信号通路减轻AMI诱导的炎症反应,减少促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α及趋化因子MIP1α、MIP2 mRNA的表达;异甘草素通过抑制TGFβ-Smad3信号通路,减轻急性心肌梗死诱导的心肌纤维化;TUNEL染色结果显示,异甘草素可以减轻急性心肌梗死诱导的细胞凋亡,促进促存活蛋白Mcl-1、Bcl-2的表达,降低促凋亡的蛋白Bad、Bax、Puma的表达。结论:异甘草素通过调控ROS介导的Nrf2/HO-1通路降低AMI诱导的氧化应激反应,抑制NF-κB信号通路减轻炎症反应,并且通过抑制TGFβ-Smad3信号通路减轻心肌纤维化。异甘草素对TGF-β-Smad3信号通路的抑制作用可能与Brcc36的表达增加,增强了对TGF-β信号通路的抑制作用有关。