1、188Re标记重组人纤溶酶原Kringle5的实验研究;2、辐射调控杆状病毒介导肿瘤治疗的实验研究

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fuji2009
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目的:采用基因工程方法表达具有血管生成抑制作用的重组人纤溶酶原kringle5蛋白(rhk5),进行核素188Re标记、体外特异性研究、体内生物学分布、显像和治疗研究及micro PET/CT进行的疗效评价研究。   方法:采用PCR方法扩增出k5基因后,克隆进原核表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21-CodonPlus感受态细菌;IPTG诱导表达重组人纤溶酶原Ktingle5 His·Tag融合蛋白(rhk5);此外同时用杆状病毒表达系统进行了蛋白的真核表达。通过镍柱亲合纯化目的蛋白rhk5,并经免疫印迹法加以证实;以内皮细胞增殖抑制试验(MTT法)检测蛋白活性;以三羰基铼间接法标记制备188Re-rhk5;以竞争结合试验观察188Re-rhk5对HUVEC的特异性亲合作用;在荷A549肺腺癌裸鼠体内进行188Re-rhk5体内分布和肿瘤显像研究及188Re-rhk5的肿瘤治疗研究;使用micro PET/CT早期无创评价肿瘤治疗效果;采用病理学及免疫组织化学方法验证其治疗作用。   结果:;原核表达载体pET-22b(+)-k5构建成功,在大肠杆菌中rhk5获得高效表达。经镍柱亲和层析纯化,纯度达到90%以上,产率为20 mg/L。真核表达产率为1 mg/L(蛋白活性与原核表达相当,但产量低,故选用原核方式大量表达蛋白)。rhk5蛋白具有生物活性,以剂量依赖方式抑制血管内皮细胞增殖,4μg/mL时对细胞的抑制率达50%。188Re-rhk5的标记率可达66.1%,放化纯度大于95%。并且具有与血管内皮细胞特异性结合的能力。静脉注射188Re-rhk5后,除肾脏的高摄取外,在肿瘤部位可见放射性逐渐浓聚。初步治疗实验显示188Re-rhk5组肿瘤率为37.2%;188Re组也可见到肿瘤抑制效果,但低于188Re-rhk5组。rhk5蛋白治疗组和生理盐水对照组则未见肿瘤生长受到抑制。18F-FLT及18F-FDG micro PET/CT显像在肿瘤188Re-rhk5治疗早期即发生改变,可在治疗早期进行无创疗效评价和预测。   结论:1.使用原核表达载体pET-22b(+)-k5及杆状病毒真核表达系统在体外表达和纯化rhk5蛋白成功,得到的重组人源纤溶酶kringle5(rhk5)蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖的活性。2.三羰基铼法标记rhk5方法可行,标记过程未影响rhk5生物活性。3.188Re-rhk5可在肿瘤及其新生血管密集部位积聚,用于肿瘤显像。4.188Re-rhk5可以实现对肿瘤及其新生血管的放射治疗作用。5.18F-FDG及18F-FLTmicro PET/CT显像是荷瘤裸鼠肿瘤188Re-rhk5治疗早期疗效评价的好方法。   目的:人钠碘同向转运体(human sodium/iodide symporter,hNIS)基因是介导肿瘤靶向基因治疗引人瞩目的基因之一,通过载体将hNIS基因转入肿瘤细胞(本实验采用U87脑胶质瘤),使之表达hNIS,进而通过细胞的放射性碘摄取达到肿瘤显像及放射治疗的目的。但是存在碘在细胞内滞留时间短的问题,使细胞所受辐射剂量不足,影响了疗效。目前研究认为增加碘的摄取可弥补碘滞留时间短的问题,为增加碘在细胞内的浓聚,本研究拟用对辐射敏感的早期生长反应(early growth response,Egr1)启动子来启动hNIS表达,hNIS表达增加促进碘摄取,碘进而刺激hNIS表达,增加碘摄取,提高疗效。   方法:按照Bac-to-Bac杆状病毒系统操作手册进行辐射敏感的Egr1启动子启动的重组hNIS杆状病毒(Bac-Egr1-hNIS)制备。病毒体外感染U87肿瘤细胞并采用131I刺激,经处理的U87细胞通过免疫荧光检测其hNIS蛋白的表达及定位,通过流式细胞术检测hNIS蛋白在131I刺激前后的表达效率变化;通过动态摄碘实验及高氯酸钠摄碘抑制实验进一步验证所表达的hNIS蛋白的功能和特性;通过调节131I刺激的浓度梯度来研究辐射诱导hNIS表达的规律;通过流出实验来检测131I刺激是否可以提高碘滞留;通过细胞克隆形成实验观察131I对感染U87细胞的杀伤作用;通过皮下接种U87脑胶质瘤细胞,建立荷瘤裸鼠动物模型;观察Bac-Egr1-hNIS对在体U87细胞的体内感染情况,并通过131I进行显像及刺激后显像治疗研究;采用蛋白印迹和免疫组化实验来证实131I刺激前后hNIS蛋白表达的变化情况。   结果:成功构建了Egr1启动的含有hNIS基因的重组杆状病毒基因治疗载体Bac-Egr1-hNIS,体外感染U87细胞后,免疫荧光和流式细胞术检测表明131I刺激后可增加hNIS的表达。感染后细胞表达的hNIS蛋白位于细胞膜上,且具有摄碘的功能和高氯酸钠抑制的特性;Bac-Egr1-hNIS感染细胞后摄碘率为未感染细胞的17倍;如果采用131I刺激,hNIS的表达可再增加到1.92倍。131I刺激并不能阻止碘的快速流出,流出实验显示前2 min就有50%的碘流出。体外杀伤实验表明,Bac-Egr1-hNIS感染的肿瘤细胞可被131I有效杀伤。初步动物实验研究表明,Bac-Egr1-hNIS能够感染裸鼠皮下接种的U87肿瘤细胞,介导131I摄取,131I刺激后进行再次显像可见hNIS介导的131I摄取增高,但是并不能减低肿瘤内131I的排出。Bac-Egr1-hNIS介导的131I治疗实验肿瘤抑制率为24.7%。   结论:杆状病毒可介导hNIS蛋白表达。131I辐射诱导Bac-Egr1-hNIS介导的碘摄取是提高U87肿瘤细胞体内外hNIS表达及碘摄取的有效方法,但若要达到更好的治疗效果,仍需要进一步采取措施增加碘滞留。
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