目的慢性脑灌注不足(CCH)可能导致各种神经系统疾病或精神疾病,CCH与学习和记忆功能障碍密切相关,尤其是血管性痴呆,表现为认知障碍和行为不良,CCH动物模型可以由中断两侧颈动脉主干的大鼠制备(称作2VO大鼠),2VO大鼠脑血流量不足导致大脑皮层、海马体和白质慢性低灌注,从而发生认知功能障碍和不良的新陈代谢,最终导致神经元损伤,可发生血管性痴呆。据报道称肾素-血管紧张素系统(RAS)为内环境平衡的重要调控系统,并被认为是治疗慢性脑灌注不足CCH诱发的认知功能障碍的潜在靶点。血管性痴呆主要病因之一是脑血流量减少诱发的活性氧(ROS)的过度表达。活性氧的超表达作为RAS过程一部分,可作为氧化应激开始的标志,这被定义为活性氧ROS和与抗氧化反应间平衡被打破的标志。过量的ROS和自由基会导致严重的细胞损伤,包括膜脂质过氧化作用,DNA断裂及损伤和蛋白质损失,在大脑中,活性氧的过量产生能够导致神经细胞及星形胶质细胞的死亡及细胞凋亡,从而导致永久性神经损伤。ROS生成和其有害影响不仅在血管性痴呆存在,也见于中枢神经系统缺血性、出血性及再灌注条件下的病变。就这一点而言,ROS清除化合物在各种疾病模型中被广泛测试以减少活性氧水平。葛根素,一种异黄酮,可以在许多植物和草药中发现,如葛根的根。葛根素也是常用于治疗发烧和腹泻的中药。事实证明,葛根素具有清除活性氧和减少脂质过氧化反应的能力。葛根素也被证明在不同种类的神经系统疾病中有神经保护作用,如阿尔茨海默氏症,帕金森氏病和脑缺血。关于葛根素的保护作用,其清除活性氧的能力是在大部分的研究中被重点提及的。一些研究还关注到葛根素在特殊的细胞类型中具有抗凋亡的活力。然而关于葛根素对血管性痴呆的保护作用目前尚无此类研究。在本研究中,我们试图通过2 VO大鼠模型验证葛根素对慢性缺血引起的血管性痴呆具有保护作用。进一步验证葛根素能够减轻血管性痴呆所致的认知和行为障碍。推论葛根素在2 V0大鼠模型中的保护作用可能是通过清除ROS以减少氧化应激反应达到的。方法6到8周成年雄性Wistar大鼠作为实验动物,经由中断两侧颈动脉主干制备2VO大鼠模型,给予或不给予葛根素治疗。采用莫里斯水迷宫测试大鼠的学习和记忆功能。丙二醇(MDA),谷胱甘肽过氧化物酶和总硫醇评估用于反映脑组织的氧化应激。SH-SY5Y细胞培养后给予过氧化氢模拟氧化应激,给予或不给予葛根素治疗,通过细胞计数Kit-8(CCK8)和流式细胞术(FCM)进行检查细胞不同时间点及给予不同浓度葛根素治疗后的生存率和凋亡率。活性氧(ROS)的产生由2’,7’二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA)检验。采用qPCR和Western blot (WB)方法测试Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4.基因表达的变化,探讨葛根素的分子作用机制。结果1、莫里斯水迷宫试验中2VO组动物逃脱时间比假手术组呈现显著延迟(P<0.05)。在2VO加葛根素干预组中逃脱时间较2VO组明显缩短,改变显著(P<0.05)。假手术组动物给予葛根素干预后逃脱时间未见明显改变。在目标象限花费的时间测试中,2VO模型组在目标象限区域花费的平均时间较短,与假手术组差异显著(P<0.05)。在2VO加葛根素干预组在目标象限区域花费的平均时间有所延长,与2VO差异显著(P<0.05)。假手术组动物给予葛根素干预后在目标象限区域花费的平均时间没有任何改变。四组动物的游泳速度无显著差异。2、在2VO组海马和额叶皮质区的丙二醛含量较假手术组明显提高(P<0.05)；葛根素干预组可以显著下调海马和额叶皮层升高的MDA水平(P<0.05)；假手术组给予葛根素干预对丙二醛含量没有任何影响。2VO组的谷胱甘肽过氧化物酶浓度较假手术组较低,具有统计学差异(P<0.05)；葛根素干预组显示了葛根素对谷胱甘肽过氧化物酶浓度较大部分修复作用(P<0.05)；假手术组给予葛根素干预与假手术组比较未显示任何差异。2VO组的总硫醇浓度较假手术组显著减少；葛根素干预组可以部分提高2V0组减少的总硫醇浓度；假手术组给予葛根素干预与假手术组比较未显示任何有统计学意义的变化。3、以过氧化氢作为氧化应激物刺激SH-SY5Y细胞后,给予或不给予葛根素治疗均评估细胞的存活率。葛根素治疗在三个不同浓度:0.1umol/1,0.5umol/l和1umol/l。分别在12小时,24小时和48小时检测细胞存活率。结果表明,过氧化氢诱发的氧化应激在三个时间点均下调细胞的存活率。葛根素治疗上调SH-SY5Y细胞的细胞存活率呈剂量依赖性。1umol/1葛根素治疗组改善效果最好,几乎达到对照组的相同水平。然后我们检测了氧化应激后的细胞凋亡率,结果与前相反,葛根素治疗降低SH-SY5Y细胞的细胞凋亡率呈剂量依赖性,1umol/1葛根素治疗组改善效果最好,几乎达到对照组相同的水平。4、为了进一步探索葛根素对活性氧的清除能力,我们在SH-SY5Y细胞中通过DCFH-DA测定做ROS清除能力试验。细胞内ROS水平通过DCFH-DA来分析,因为DCFH-DA在细胞间具有渗透性,且对氧化敏感。给予氧化氢诱导24小时后,培养基换做含有不同剂量葛根素的培养基。葛根素治疗12小时或24小时后,通过DCFH-DA分析测定细胞内ROS水平。DCF荧光强度的定量分析显示给予过氧化氢诱导的未治疗组显示荧光水平最高。葛根素治疗组的ROS阳性细胞数在12小时和24小时均显著下调。1 umol/1浓度葛根素组与其他组比较显示最好的活性氧清除能力(P<0.05)。葛根素减少SH-SY5Y细胞内DCF荧光存在明显剂量依赖性。5、我们通过qPCR和免疫印迹进行测试Nrf2、FoxO1 FoxO3和FoxO4基因表达的变化。结果,我们发现,虽然葛根素治疗组可以显著提高Nrf2 mRNA的表达,但过氧化氢对Nrf2的mRNA水平并没有影响。至于FoxO家族,通过氧化氢诱导FoxO1 FoxO3 FoxO4提高了在mRNA水平表达。葛根素治疗增强了过氧化氢的FoxO1 FoxO3 FoxO4在mRNA水平表达增高的效应(P<0.05)。这个结果与通过WB检测的蛋白水平的结果是一致的。WB图像的定量分析显示,这些抗氧化应激基因的表达是根据mRNA水平改变情况以不同的模式被上调的。结论1、我们的研究结果表明,无论是体内环境慢性缺血诱发的还是体外过氧化氢诱发的氧化应激反应,葛根素干预后均可以有明显逆转作用。对于2V0老鼠,葛根素干预也会提高学习能力和巩固记忆,我们发现葛根素的保护作用都与葛根素对ROS的清除能力密切相关,无论是慢性缺血诱发的还是体外过氧化氢诱发的反应,此现象也能解释葛根素体外试验的抗凋亡活力。在分子水平,我们发现葛根素的治疗作用与几种抗氧化蛋白表达相关,mRNA水平, Nrf2、FoxO1 Fox03和Fox04蛋白质水平均显著上调。还有一个有趣的发现,过氧化氢处理也可以上调Nrf2的表达。2、我们的研究中2V0老鼠被选为体内动物模型,双侧的颈总动脉结扎可能导致大脑全球缺血。两个目标区域,即海马和额叶皮质,几乎全部受到这个缺血影响,其中海马负责学习和记忆功能。然后我们使用莫里斯水迷宫测试每组的学习和记忆功能。所有结果表明葛根素对2V0老鼠受损的学习和记忆能力具有保护作用。3、已经证实氧化应激在缺血和缺氧性脑损伤中扮演着关键角色。氧化应激也与炎性细胞因子的过度表达和血管受损导致的认知功能障碍相关。活性氧能够氧化膜脂质,细胞蛋白质和细胞核内的核酸,最终导致细胞功能障碍。考虑到这个,我们重点关注2V0大鼠脑组织中ROS的过度生成和自由基的产生,我们测量了MDA的水平,这是脂质过氧化反应的一个标志。谷胱甘肽过氧化酶和硫醇含量分别测量体外试验中对抗活性氧生成的酶促和非酶促性防御反应。为了进一步解释葛根素在体外试验中对ROS的清除能力,选取SH-SY5Y细胞进行培养,给予过氧化氢作为刺激物施加刺激,模拟体内状态时缺血诱导的氧化应激状态。我们的结果指出葛根素治疗能够减少过氧化氢诱导的细胞凋亡。我们发现葛根素治疗部分逆转了过氧化氢诱导的氧化应激反应的不利影响,呈计量依赖性。4、为了探索其潜在机制,我们重点关注调控因子FOX O家族(FoxO)和Nrf2的表达。FoxO家族通过提高几种抗氧化酶的氧化还原信号的表达以减少ROS生成。FoxO家族蛋白质也是调控细胞增殖,分化,细胞凋亡,细胞周期逮捕和自噬的转录因子。另一个我们关注Nrf2基因,也调节对氧化损害有保护作用的抗氧化蛋白质。FoxO家族和Nrf2在中枢神经系统具有重要的生理功能和病理作用。我们首次报道了葛根素治疗作用与上调缺血大脑中的这些基因具有相关性。总之,我们猜测葛根素对慢性脑缺血诱发的血管性痴呆具有保护作用表现在减轻氧化应激和提高认知能力。