【摘 要】
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目的:腱-骨界面的修复过程一般都是疤痕组织的形成,无法恢复到天然的形态及结构,也很难达到理想的生物力学强度效果。随着对天然腱-骨结构的微观解析,界面结构与其功能的紧密联系的重要性也愈加突显,模仿天然组织结构的组成来改善受损组织的再生修复策略成为了组织工程新的选择。磷酸钙液态前驱体（Ca P-PILP）,一种数纳米尺度的矿化材料,可作为基元实现精确的仿生矿化,从而实现肌腱-骨界面的仿生重构。意义:本
【基金项目】
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项目名称:基于纳米簇新型材料的生物学效应及其仿生装配复合组织的基础研究,项目合同编号:2018YFC110510,项目来源:国家重点研发计划,项目起止时间:2018年 09 月 至 2021年12月；
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目的:腱-骨界面的修复过程一般都是疤痕组织的形成,无法恢复到天然的形态及结构,也很难达到理想的生物力学强度效果。随着对天然腱-骨结构的微观解析,界面结构与其功能的紧密联系的重要性也愈加突显,模仿天然组织结构的组成来改善受损组织的再生修复策略成为了组织工程新的选择。磷酸钙液态前驱体（Ca P-PILP）,一种数纳米尺度的矿化材料,可作为基元实现精确的仿生矿化,从而实现肌腱-骨界面的仿生重构。意义:本研究旨在利用磷酸钙液体前驱体矿化肌腱组织使其成为骨组织,构建高仿生肌腱-骨移行的复合组织装配材料:磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织（PILP-tendon）,促进肌腱-骨组织缺损修复。研究将为磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织的肌腱-骨组织工程的临床化应用提供重要的理论依据。方法:1、优质天然猪的肌腱经过剥离筋膜、冻融法脱细胞等步骤使其脱细胞,脱细胞肌腱经低浓度戊二醛的交联作用,固定于冷冻包埋剂中冰切获得80微米的脱细胞肌腱薄片组织。2、配制磷酸钙液态前驱体,并将脱细胞肌腱薄片组织浸泡其中,获得磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织。3、通过投射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）、扫描电镜（Scanning electron microscop,SEM）、能谱仪（Energy Dispersive Spectrometer,EDS）、傅立叶红外光谱仪（Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR Spectrometer）、X射线衍射（Diffraction of x-rays,XRD）、热重及差示扫描量热仪（Thermal Gravimetric Analyzer,TGA）、深度敏感压痕技术（DepthSensing Indentation,DSI）等对磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织进行表征。4、CCK-8细胞增殖分析与活死细胞染色检测磷酸钙液态前驱体矿化肌腱生物相容性。5、检测磷酸钙液态前驱体矿化的肌腱薄片组织对间充质干细胞细胞系（C3H）向骨系分化能力。6、在小鼠动物异位成骨的体内模型中,通过小动物活体断层扫描成像系统（micro-CT）、定量分析和组织学染色检测磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织在体内促进成骨情况。7、在大鼠髌腱-骨缺损模型中,通过万能材料试验机进行力学测试,通过组织学染色评估髌腱-骨的修复情况,TEM观察组织胶原纤维的多少,了解修复肌腱-骨超微结构。结果:1、磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织有明显的钙机磷酸基团的特征,电镜结果也显示肌腱胶原内有矿化现象,说明矿化肌腱薄片组织内部有钙磷沉积;2、CCK-8细胞增殖分析与活死细胞染色结果表明磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织不影响细胞生长与增殖,扫描电镜结果显示种植在矿化肌腱组织上的C3H细胞形态会发生改变;3、在磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织影响下,C3H细胞表现出较高的碱性磷酸酶活性,免疫荧光染色中骨系相关因子表达明显,q PCR中骨质分化标志的基因表达水平明显高于对照组;4、在小鼠异位成骨的体内模型中,结果提示磷酸钙前驱体矿化肌腱薄片组织种植在皮下有新生的骨组织,种植在骨髓道中可与其内表面骨质交叉融合生长;5、在大鼠髌腱-骨缺损模型中,发现磷酸钙液态前驱体矿化肌腱薄片组织的力学性能较对照组有增强;TEM结果显示有明显的骨胶原纤维生成,组织学结果显示了肌腱-骨组织缺损部位的有新生的骨组织和过渡区域。结论:该研究验证了磷酸钙液态前驱体能够矿化肌腱薄片组织,使肌腱胶原内矿化,促进肌腱胶原向骨胶原转化。磷酸钙液态前驱体与肌腱胶原装配构建的PILP-tendon,不仅具有良好的生物相容性,促进间充质干细胞系成骨分化,还在体内实现了肌腱-骨复合组织的仿生重构。
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