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目的:甲状腺激素（TH）对正常的大脑发育至关重要。TH主要通过甲状腺激素核受体（thyroid hormone receptor,TR）α和β发挥作用,调控基因的转录。编码TRα的基因THRA突变导致α型甲状腺激素抵抗综合征（Resistance to thyroid hormoneα,RTHα）。RTHα患者表现为类似甲状腺功能减退症的临床特征,神经系统表现包括智力发育迟缓,认知障碍,书写困难,步态异常,甚至癫痫发作等。目前对于认知和运动障碍尚无有效的治疗方法。我们根据首例TRα1基因突变患者突变位点构建了Thra E403X基因突变的小鼠模型,前期实验结果显示,Thra E403X基因突变小鼠的临床表型与人类疾病表型基本一致:出现了明显的幼年期身高、体重发育延迟,其中神经系统表型非常明显,提示ThraE403X基因突变小鼠是研究TRα1对脑发育影响的理想动物模型。为了探讨ThraE403X基因突变导致脑发育异常的分子机制,我们对3周龄小鼠的大脑皮层进行了蛋白组学和磷酸化修饰蛋白组学分析,并对差异表达蛋白进行了功能分类与通路富集分析。GO富集分析显示,“细胞骨架”、“突触”、“细胞骨架结构构成”等GO条目被富集到。KEGG信号通路富集分析显示,“钙离子信号通路”通路被富集到。因此我们把重点聚焦在细胞骨架及其相关蛋白的磷酸化蛋白上,发现tau蛋白的7个磷酸化位点发生了显著的上调。提示Thra E403X突变导致了小鼠大脑皮层tau蛋白过度磷酸化。本研究旨在探讨Thra E403X基因突变导致tau蛋白过度磷酸化的分子机制。研究方法:1、8-10周龄Thra E403X/+杂合子雌鼠和雄鼠交配,选取3周龄野生型Thra+/+、纯合型Thra E403X/E03X后代作为研究对象。体外实验选取出生第一天的新生小鼠,进行小鼠大脑皮层神经元原代培养。2、应用大脑皮层组织进行磷酸化修饰TMT标记定量蛋白质组学分析;并对蛋白质组学数据进行差异蛋白功能分类、差异表达蛋白功能富集分析等生物信息分析。3、HE染色观察Thra E403X/E03X小鼠大脑组织病理形态学变化。4、使用免疫印迹法检测Cleaved caspase-3表达,评估突变对神经细胞凋亡的影响。5、使用免疫印迹法检测髓鞘相关蛋白的表达。6、利用PHF-tau（AT8）抗体,免疫组织化学染色和免疫荧光方法检测神经原纤维缠结沉积。7、应用q PCR方法,检测tau蛋白的mRNA水平表达情况。8、利用免疫印迹方法,检测tau总蛋白的表达水平、tau多个位点的磷酸化水平。9、使用免疫印迹法检测tau蛋白磷酸化的关键激酶、磷酸酯酶的表达水平。10、利用免疫印迹方法检测Thra E403X/E403X小鼠及Thra+/+小鼠大脑皮层原代神经元CaMKII、tau蛋白的磷酸化水平。11、CaMKⅡ特异性激酶抑制剂KN93处理小鼠原代皮层神经元,并检测tau磷酸化的表达。12、利用荧光探针Fluo4-AM检测胞内钙离子浓度。13、q PCR和免疫印迹法检测小鼠皮层组织质膜钙泵Atp2b2的mRNA和蛋白表达情况。14、使用Graph Pad Prim 8.0软件对数据进行统计学分析。数据采用均数±标准误（Mean±SEM）表示,两组数据比较采用Student’s t检验。P＜0.05时具有统计学差异。结果:1、磷酸化蛋白质组学结果表明,Thra E403X突变导致445个蛋白和556个磷酸化位点发生了显著的差异表达,329个蛋白上调,116个蛋白下调;414个磷酸化位点上调,142个磷酸化位点下调。2、Thra E403X/E03X小鼠大脑皮层凋亡蛋白Cleaved caspase 3升高（P＜0.05）。3、Thra E403X/E03X小鼠大脑皮层髓鞘相关蛋白下降（P＜0.05）。4、免疫组化方法证实3周龄Thra E403X/E03X小鼠大脑皮层组织存在神经纤维缠结。5、3周龄Thra E403X/E03X小鼠大脑皮层组织tau蛋白的多个AD相关磷酸化位点磷酸化水平升高（P＜0.05）,包括Ser202,Thr231,Ser396,Ser404。tau蛋白的mRNA和蛋白水平无明显差异。6、3周龄Thra E403X/E03X小鼠大脑皮层组织tau蛋白激酶p-CaMKⅡ的水平显著高于对照组（P＜0.05）,其它tau蛋白磷酸化相关的激酶p-GSK3β、p-CDK5、p-JNK、p-ERK、p-P38和磷酸酯酶p-PP2A、de Me-PP2A的表达水平与对照组没有统计学差异。7、Thra E403X/E03X小鼠皮层原代培养神经元,p-tau、p-CaMKⅡ蛋白明显升高;CaMKII抑制剂KN93处理后,与对照组相比,Thra E403X/E03X小鼠皮层原代神经元的p-tau无明显升高。8、Thra E403X/E03X小鼠皮层原代培养神经元胞内钙离子浓度明显增高。9、Thra E403X/E03X小鼠皮层质膜钙泵Atp2b2的mRNA和蛋白水平明显下调。结论:1.Thra E403X突变导致小鼠大脑皮层蛋白磷酸化修饰谱改变。2.Thra E403X突变可能通过抑制Atp2b2的表达,引起大脑皮层神经元内Ca2+排出障碍,导致神经元内钙超载,钙超载激活了其下游CaMKII激酶通路,导致tau蛋白过度磷酸化,进而导致大脑皮层神经元凋亡。