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作为一种μ-阿片受体激动剂,瑞芬太尼能够快速起效与清除,并且不发生蓄积,因而在临床麻醉时得到广泛青睐。但瑞芬太尼痛觉过敏的发生概率明显高于其他阿片类药物,这在很大程度上限制了瑞芬太尼的临床应用,阐明其机制有助于制订预防其诱发痛觉过敏的措施。前期有研究证实,在瑞芬太尼所致痛觉过敏的发生和维持这一过程中,NMDA受体活化-钙离子内流增多-PKC激活这一系列反应所介导的脊髓中枢敏化参与其中。NMDA受体与AMPA受体,两者均是兴奋性谷氨酸离子通道型受体。上述两种受体大量分布于脊髓背根神经节及其背角浅层。两者的功能相似,参与上传疼痛信号,并且介导形成脊髓中枢敏化。而蛋白激酶Cα相互作用蛋白1(PICK1)在人和动物的组织中均有表达,是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)的靶蛋白之一,也是在PKCα和突触后膜AMPA受体蛋白间起重要作用的衔接蛋白。且有研究发现,PICK1参与了炎症诱发的痛觉过敏的形成和维持。但PICK1在瑞芬太尼痛觉过敏时对于AMPA受体的运输和表达的影响未见报道。因此本研究拟探讨PICK1及AMPA受体亚单位运输的变化及调节在瑞芬太尼痛觉过敏形成机制中的作用。第一部分:瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1表达水平的变化目的通过评价瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1表达水平的变化,探讨PICK1在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的可能机制。方法SPF级雄性SD大鼠16只,体重240~260g,42~49日龄,尾静脉置管成功后,采用随机数字表法分为2组(n=8):瑞芬太尼组(R组):按1.2μg·kg-1·min-1的标准给大鼠输注瑞芬太尼(经尾静脉),输注时间为60min;对照组(C组):经尾静脉置管输注等体积的生理盐水0.12 ml·kg-1·min-1,输注时间为60min。分别于生理盐水或瑞芬太尼输注前24h、停止输注后2、6、24和48 h时测定机械缩足反应阈(PWT)和热缩足潜伏期(PWL)。于输注后48 h测定痛阈后处死大鼠,取L4~6节段脊髓,采用RT-qPCR法测定PICKl mRNA表达水平,采用Western blot法测定PICKl蛋白表达水平。结果R组PWT降低、PWL缩短(P<0.05)。且R组PICK1 m RNA及蛋白表达水平均升高(p<0.05)。结论输注瑞芬太尼导致了痛觉过敏;瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓pick1mrna及蛋白表达水平上调,这种改变有可能与形成瑞芬太尼痛觉过敏有关。第二部分:瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓ampa受体亚单位表达及运输水平的变化目的通过测定大鼠发生瑞芬太尼痛觉过敏时,脊髓组织中ampa受体亚单位表达水平的改变以及对其运输情况的影响,从而探究该受体亚单位的表达水平以及运输改变是否以及如何参与瑞芬太尼所致的痛觉过敏。方法spf级雄性sd大鼠16只,体重240~260g,42~49日龄,尾静脉置管成功后,采用随机数字表法分为2组(n=8):瑞芬太尼组(r组):按1.2μg·kg-1·min-1的标准给大鼠输注瑞芬太尼(经尾静脉);对照组(c组):经尾静脉置管输注生理盐水0.12ml·kg-1·min-1,输注时间为60min。分别于生理盐水或瑞芬太尼输注前24h、停止输注后2、6、24和48h测定机械缩足反应阈(pwt)和热缩足潜伏期(pwl)。于输注后48h测定痛阈后处死大鼠,取l4~6节段脊髓,采用免疫荧光染色法观察脊髓背角glur1、glur2、glur3阳性细胞的表达。采用westernblot法测定脊髓细胞膜(s)及胞浆内(i)ampa受体glur1、glur2及glur3亚单位的表达。结果与c组比较,r组pwt降低、pwl缩短(p<0.05)。且r组脊髓背角glur1、glur3亚单位阳性细胞表达增多,glur2表达减少(p<0.05);sglur1、sglur3表达增加,sglur2表达减少(p<0.05),iglur1、iglur2和iglur3表达无明显变化(p>0.05)。结论输注瑞芬太尼导致了大鼠的痛觉过敏;大鼠发生瑞芬太尼痛觉过敏时,其脊髓组织中的ampa受体glur2阳性细胞表达减少,glur1、glur3亚单位阳性细胞表达增多;glur1、glur3向细胞膜转运增加、glur2向胞浆内化增加,该变化可能参与了瑞芬太尼痛觉过敏形成的机制。第三部分:pick1反义寡核苷酸对大鼠瑞芬太尼痛觉过敏时脊髓组织中ampa受体亚单位表达及运输水平的变化的影响目的通过pick1反义寡核苷酸敲低大鼠脊髓pick1蛋白的表达水平,评价pick1对于瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓ampa受体glur1、glur2、glur3亚单位表达及运输的变化的影响。方法:parta:spf级雄性sd大鼠96只,体重240~260g,42~49日龄,采用随机数字表法分为3组(n=32):对照组(NS组)、PICK1反义寡核苷酸组(AS组)、PICK1错义寡核苷酸组(MS组)。三组均鞘内置管:NS组经鞘内置管给予10μl生理盐水;AS组经鞘内置管给予10μg/10μl PICK1反义寡核苷酸(ASDON),MS组经鞘内置管给予10μg/10μl PICK1错义寡核苷酸(MSDON)。每日给药1次,连续4d。第5d~8d每天随机处死4只大鼠,取脊髓L4-6节段,采用western blot法测定脊髓PICK1蛋白表达水平的变化。Part B:确定经鞘内置管给的反义寡核苷酸起作用后,分别取NS组、AS组的剩余大鼠进行尾静脉置管,随机分为4组(n=8):NS+R组和AS+R组分别经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-160 min;NS+NS组和AS+NS组分别经尾静脉置管输注与瑞芬太尼等容量生理盐水60min(速率为0.12 ml·kg-1·min-1)。分别于生理盐水或瑞芬太尼输注前24h、停止输注后2、6、24和48 h时测定PWT、PWL。于输注后48 h时测定痛阈后处死大鼠,取L4~6节段脊髓,采用免疫组化染色法观察脊髓背角GluR1、GluR2、GluR3亚单位阳性细胞的表达。采用western blot法测定脊髓细胞膜(s)及胞浆内(i)AMPA受体GluR1、GluR2及GluR3亚单位的表达。结果与NS+NS组比较,NS+R组和AS+R组PWT降低、PWL缩短(P<0.05);脊髓背角GluR1、GluR3亚单位阳性细胞表达增多、GluR2表达减少(P<0.05);sGluR1、s GluR3表达增加,sGluR2表达减少(P<0.05),iGluR1和iGluR2表达无明显变化(P>0.05)。与NS+R组比较,AS+R组PWT升高、PWL延长(P<0.05);脊髓背角GluR1亚单位阳性细胞表达无明显改变(P>0.05),GluR3阳性细胞表达降低,GluR2表达增多(P<0.05);sGluR3表达降低,sGluR2表达增多(P<0.05)。sGluR1、iGluR1、iGluR2和iGluR3表达无明显变化(P>0.05)。结论PICK1通过调节脊髓组织中AMPA受体的GluR2、GluR3这两个亚单位,影响其表达和运输,介导瑞芬太尼痛觉过敏的过程,而其对GluR1亚单位在表达和运输并无影响。