刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界范围寄生的原虫。它是专性细胞内寄生原虫。近乎所有的温血脊椎动物都可以被感染。野生动物、家畜和宠物常有该病发生。缺乏有效的药物治疗导致弓形虫对公共卫生和畜牧业造成极大危害。弓形虫循环抗原(CAg)是弓形虫急性感染过程中出现在动物血液循环中的弓形虫相关抗原,CAg检测是早期感染的可靠指标。血清中循环抗原的主要成分来自弓形虫自身的排泄和裂解产物(ESA)。微线体蛋白、致密颗粒蛋白和棒状体蛋白是弓形虫ESA的主要成分。为探讨弓形虫致密颗粒蛋白GRA1和微线体蛋白MIC4诊断方面的意义,对其进行原核高效表达。采用逆转录PCR(RT-PCR)方法扩增截短后的GRA1基因和两段抗原性好与亲水性强的mic4-1和mic4-2基因。构建表达载体进行蛋白表达。结果显示:GRA1、MIC4-1和MIC4-2三种重组蛋白均为可溶性表达,并分别在28℃、22℃和37℃温度诱导培养下高效表达;Western-blot显示,重组蛋白MIC4-1和MIC4-2不能识别弓形虫感染的犬阳性血清,但是重组蛋白GRA1能与弓形虫感染的犬阳性血清发生免疫结合反应,表明GRA1具有良好的反应原性,可以作为血清学诊断抗原。将表达的重组蛋白GRA1免疫BALB/c小鼠。利用杂交瘤技术制备单抗。筛选出两株能够稳定高效分泌特异性抗体的细胞株(1B7和1C7),效价均能达到1:6.4×10~4。间接免疫荧光实验(IFA)结果发现单克隆抗体和弓形虫自身的天然蛋白GRA1产生反应,说明本研究制备的单抗有应用于弓形虫抗原检测的前景;以ESA为抗原进行的Western-blot结果在24 kDa处有明显的条带,说明单克隆抗体能够识别存在于弓形虫排泄分泌抗原中的GRA1,说明本研究制备的单抗可以应用于弓形虫早期感染诊断。利用镧系微球试纸条技术建立检测弓形虫感染的血清抗体的方法,通过在检测线(T线)和质控线(C线)上分别包被重组蛋白和SPA来实现。结果显示上样后10-60 min是最佳检测时间,可以满足快速检测的要求;并且该试纸条对其它病原体感染的阳性血清无交叉反应;当1600倍稀释阳性血清样品时,该试纸的测试结果也显示为阳性。血清样本检测实验结果显示镧系微球试纸条检出阳性率为27.87%,分别以ELISA和商品化ELISA试剂盒检测结果为标准,计算阳性符合率分别为:93.33%和85.71%。Kappa分析揭示了镧系微球试纸条检测方法和ELISA之间一致性很好,与商品化ELISA试剂盒之间有较好一致性,并且镧系微球试纸条的灵敏度更高,证明本研究制备的镧系微球试纸条可以初步应用于弓形虫病血清检测。