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研究背景与目的:目前,卵巢癌的发病率高居我国女性生殖系统恶性肿瘤的第二位,死亡率则高居第一位。随着我国老龄化人口的加剧,卵巢癌在我国的发病率呈现逐年增加的趋势,由于卵巢位于盆腔深部,癌变发生的早期症状往往较为隐匿,导致多数患者就诊时已属晚期,往往错失了最佳的治疗时机。尽管卵巢癌对于化学治疗比较敏感,但是大多数患者在短期内即因肿瘤出现耐药而出现复发或者转移。而在美国,卵巢癌在妇科恶性肿瘤中发病率则高居首位。化疗是卵巢癌最传统的治疗方法。肿瘤细胞减压术后,以铂类为基础的辅助性化疗,具有一个高的治疗反应率(将近75%),然而,复发率和死亡率在当前仍然较高(5年存活率:20-40%)。紫杉醇(PAX)属于天然抗肿瘤植物类化疗药物,是对卵巢癌治疗最有效的的一线化疗药物之一。应用紫杉醇过程中出现的获得性耐药亦成为降低卵巢癌治疗疗效的主要限制性因素。自噬(Autophagy)是一种进化保守的代谢过程,使真核细胞能够降解并回收细胞组分进行再利用,对于肿瘤细胞的发生发展,自噬存在着双向效应。最近研究表明,部分化疗药物可以诱导肿瘤细胞出现自噬,化疗诱导的自噬促进肿瘤细胞株的存活,自噬作用可能参与了化疗耐药性的发展。PAK5为多种恶性肿瘤的致癌基因,可以促进肿瘤细胞增殖、化疗耐药、转移以及抑制细胞凋亡等多种恶性生物学行为的生成。同时PAK5的上调可激活MAPK/ERK信号通路,而后者在调节细胞自噬(autophagy)过程中起到关键作用,而关于PAK5基因、自噬以及化疗之间的关系鲜有报道。本研究通过检测PAK5在卵巢癌中的表达情况,检测紫杉醇对PAK5下调后卵巢癌CAOV-3细胞的毒性及凋亡的变化,以及紫杉醇对PAK5下调后卵巢癌CAOV-3细胞自噬水平的变化,初步探讨PAK5在卵巢肿瘤细胞自噬发生发展过程中的作用及机制。方法:1.RT-q PCR检测PAK5在卵巢癌细胞中的m RNA表达情况。2.CCK8检测紫杉醇对卵巢癌CAOV-3细胞的细胞毒性。3.流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测。4.免疫荧光双染法检测自噬相关蛋白LC3分布及表达量的变化。5.免疫印迹法检测PAK5、LC3等相关分子的表达变化。结果:1、PAK5在卵巢癌细胞系中高表达。相比较正常胃粘膜上皮细胞GES-1的PAK5的m RNA水平,RT-q PCR检测发现PAK5的m RNA水平在卵巢癌CAOV-3细胞中是其2.73倍,HO-9810中是其3.36倍,SKOV-3中是其2.45倍。2、PAK5-si RNA可以明显下调卵巢癌CAOV-3细胞中PAK5基因的表达。比较转染48小时后PAK5-si RNA组、对照质粒si RNA(NC组)以及未转染的CAOV-3细胞(Con组),RT-q PCR提示Con组及NC组相比,PAK5的m RNA表达未见明显差异(P>0.05)。而与Con组及NC组相比,PAK5-si RNA组中PAK5基因在m RNA水平表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。同样利用免疫印迹法也提示PAK5-si RNA组中PAK5基因在蛋白水平上较Con及NC组表达明显减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。3、下调PAK5的表达可提高卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。随着紫杉醇浓度的逐渐增加,紫杉醇的卵巢癌细胞毒性逐渐增加。而用特异性si RNA下调卵巢癌CAOV-3细胞中的PAK5表达,则可显著增加卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。4、下调PAK5基因可促进紫杉醇处理的卵巢癌CAOV-3细胞凋亡。CAOV-3转染PAK5-si RNA及NC-si RNA后,紫杉醇处理细胞24h,流式细胞术结果显示,紫杉醇+PAK5-si RNA转染组总凋亡率较紫杉醇+Con组及紫杉醇+NC组明显增高,而紫杉醇+NC组与紫杉醇+Con组无明显差异。5、PAK5的敲减下调紫杉醇诱导的卵巢癌细胞的自噬的形成。紫杉醇处理经转染PAK5-si RNA及NC-si RNA的卵巢癌CAOV-3细胞及Con组细胞24小时,免疫荧光显微镜显示紫杉醇诱导卵巢癌细胞自噬形成,而相比Con及NC组,在PAK5-si RNA组,紫杉醇诱导卵巢癌CAOV-3细胞自噬水平明显降低,而Con及NC组细胞自噬水平则无明显差异。同样免疫印迹结果也提示下调PAK5的表达可以明显抑制紫杉醇诱导的卵巢癌细胞自噬的形成。结论:紫杉醇可以诱导卵巢癌CAOV-3细胞自噬的表达,下调PAK5基因可以促使LC3表达减弱,抑制卵巢癌CAOV-3细胞发生自噬,可以提高卵巢癌CAOV-3细胞对紫杉醇的敏感性,降低紫杉醇获得性耐药的发生。