近年来,心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的发病率在逐年上升。心血管疾病的诱发因素比较多,其中糖尿病(diabetes mellitus, DM)是其中重要的诱因之一。糖尿病是胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用障碍所致的一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,可导致多种并发症。据报道,70%-80%的糖尿病患者都会出现全身小血管和微血管病变,而糖尿病患者的血管并发症是导致糖尿病患者致死和致残的主要原因。糖尿病患者为什么比普通人群更容易发生血管并发症呢?主要原因是慢性高血糖水平可导致血管内皮结构的改变以及正常生理功能的丧失,而内皮功能丧失是血管疾病的主要标志。众所周知,在正常生理状态下,真核生物细胞膜仅对少量小分子具有通透性,蛋白质等生物大分子必须以膜泡的形式,通过内吞或外排的作用进行批量运输。然而,生物膜的这种屏障作用在维持细胞生理结构功能完整的同时,却也大大限制了生物大分子药物对疾病的治疗作用。近年来,人们发现了一种蛋白质功能域,它们能够引领其所承载的生物大分子通过浆膜,并在细胞内积累,所以把它们称为蛋白质转导域(protein transduction domain,PTD)。被PTD带入细胞的分子都还具有它们本来的活性。因此,它们在细胞内该干什么,还干什么,会各显其能、各尽其责,这些特性使得这个技术特别具有吸引力。PTD的出现,使大分子蛋白质或多肽自由通透细胞膜成为了可能,同时疾病的另一个治疗平台——蛋白质治疗技术也成为了现实,加速了蛋白质工程技术的发展和临床上蛋白类药物的开发和利用。目前,已有数十种蛋白质被成功转导进入不同的细胞中,并被表现其相应的生物活性,还有部分蛋白被转导进入动物体内。随着其作用机理的阐明和这一技术的日益成熟,将被越来越广泛的应用到疾病治疗方法的研究以及未知蛋白功能的研究中。A20属锌指蛋白家族,其在抗炎、抗凋亡、抑制排斥反应以及各种疾病对内皮的损伤中均具有重要的保护作用,目前,A20被认为是内皮细胞的保护基因。许多学者也认为A20可能是将来临床治疗炎症性疾病的新措施。但以往关于A20的绝大多数研究,主要围绕在基因水平上进行的,例如,通过脂质体、病毒载体等结构将A20基因转运进入细胞或生物体中使之大量表达,从而改变细胞或生物的表型。但在实际操作过程中,往往存在这样那样的问题,如可操作性差,转运效率低,稳定性不好,生物毒性作用,而且并非所有细胞均能被转染等,这些均限制了其实际应用。使得目前关于A20的研究只能局限在细胞或者动物的水平上,严重阻碍了这一重要基因向临床治疗中的发展。如果能够体外得到大量的有生物学活性的hA20(human A20)蛋白,而且该蛋白又能穿过细胞膜,在细胞内发挥其本来的生物学活性,那么hA20的应用范围将大大拓展。但体外获得的重组蛋白PTD-hA20能否顺利穿过细胞膜进入到细胞内,外源性hA20蛋白能否对高糖环境下的内皮细胞起保护作用,能否有效地抑制高糖所致的内皮细胞损伤与凋亡?能否对糖尿病引起的心血管疾病具有治疗作用?这些问题都值得我们去研究并且目前国内外还未见报道。针对上述问题,本课题拟:一通过载体构建得到重组质粒pPIC9k-PTD-hA20。二将重组质粒pPIC9k-PTD-hA20转化毕赤酵母GS115,通过G418浓度梯度筛选出蛋白高表达菌株,对高表达菌株进行甲醇诱导表达,得到含有目的蛋白的酵母上清液,对酵母上清液进行纯化,得到较纯净的目的蛋白。三通过细胞培养、高糖细胞模型的建立对重组蛋白的穿膜作用和生物学活性进行鉴定。本课题的研究共包括三部分:第一部分:PTD-hA20融合基因真核表达载体的构建及鉴定实验根据已知的目的基因片段的序列自行设计引物,通过PCR方法得到了融合基因片段PTD-hA20 ,通过酶切、连接等方法成功地构建了真核表达载体pPIC9k-PTD-hA20,酶切鉴定结果与测序结果均表明该重组质粒与预期结果相同。第二部分:酵母的转化、蛋白高表达菌株的筛选、重组蛋白的诱导表达及纯化实验利用电转化的方法,成功地将重组质粒pPIC9k-PTD-hA20导入毕赤酵母GS115,并通过G418浓度梯度筛选得到了蛋白高表达菌株,并对蛋白高表达菌株进行甲醇诱导表达,得到了含有目的蛋白的酵母上清液。将上清液经过Ni-NTA树脂柱子纯化后,去除了绝大多数杂蛋白,获得了较纯净的目的蛋白。第三部分:人脐静脉内皮细胞的培养、鉴定、高糖细胞模型的建立以及外源性锌指蛋白hA20的保护作用成功培养了人的原代脐静脉内皮细胞,建立了高糖细胞模型。实验结果表明高糖可以诱导内皮细胞损伤和凋亡,使内皮细胞中P-选择素和Caspase-3的表达水平大大增加。重组蛋白PTD-hA20不但具有较好的穿膜活性,而且能显著抑制高糖引起的内皮细胞损伤和凋亡。hA20可能对由糖尿病引起的血管病疾病有一定治疗作用。本实验成功构建了重组质粒pPIC9k-PTD-hA20,得到了纯净的目的蛋白。该重组蛋白不但具有较好的穿膜能力而且具有较强的生物学活性,为hA20的研究和应用提供了一条更为安全和便利的途径,也可能用于临床上由糖尿病引起的血管并发症的治疗。