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胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,简称IGFs),又称类胰岛素样生长因子,是一类多功能细胞增殖调控因子。该家族中的胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1)是一种由70个氨基酸组成的分子量为7650Da的单链、肽类生长因子。IGF-1具有广泛的生物学功能,在许多疾病的治疗中都具有重要的应用价值,其研究前景非常广阔。但其天然含量少且提取困难,市售价格昂贵,因此人工构建并表达IGF-1分子是开展其他研究的前提。 本论文中将人工合成的IGF-1基因重组到表达载体pGEX-2T中,构建成pGEX-2T-IGF-1原核表达重组质粒,再将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,通过热裂解PCR方法筛选得到阳性克隆,并通过测序确定了其正确性。 将所构建的IGF-1表达质粒,经IPTG (isopropyl-1-thio-beta-D-galactoside,IPTG)诱导表达,收集细胞裂解、SDS-PAGE电泳检测结果表明,IGF-1成功获得表达。进一步对诱导时间、诱导温度和培养基pH值进行优化,通过SDS-PAGE检测确定了最适表达条件为37℃、pH7.2、5小时,此条件下上清和包涵体中目的蛋白的表达总量最高,占菌体总蛋白的35%左右,表明IGF-1在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达。得到的融合蛋白可以经亲和层析进行初步分离纯化,一步纯化率可达75%。 凝血酶识别特异性酶切位点酶切除去GST后,采用弱阳离子交换色谱法进行包涵体复性同时纯化,并筛选了流动相组成、还原/氧化谷胱甘肽比例、流速和温度这些条件,确定了最佳的复性、纯化条件。利用亲和层析和离子色谱法组合的方法分离纯化得到重组胰岛素样生长因子-1。组合了两种纯化方案,纯化后纯度能达到92%,产物质量回收率为60%。且与稀释法比较发现,色谱法的复性回收率明显高于稀释法。 MTT法活性检测分别以IGF-1标准品、GST-IGF-1融合蛋白、和空白组作对照。结果重组IGF-1蛋白GST-IGF-1融合蛋白及IGF-1标准品均具有促进细胞增殖的作用,重组IGF-1蛋白的活性比IGF-1标准品的活性略低,而GST-IGF-1融合蛋白的活性则很微弱。由此我们获得了具有活性的高纯度IGF-1,为今后的研究应用奠定了基础。