猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS）又称猪气喘病,是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, MHP）引起的,感染猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病。猪群在感染MHP后,很容易继发感染其他病原,增’加了猪病诊断和预防控制的难度。此外,MPS会导致感染猪群的饲料转化率降低,增重减缓,严重危害全球养猪业的发展。同其他传染病的防治一样,MPS的控制也主要采取免疫接种的方式。目前预防MPS的商用疫苗主要是常规灭活疫苗和弱毒疫苗。但是猪肺炎支原体的培养条件苛刻,制备灭活疫苗或弱毒疫苗的成本相对较高。因此,迫切需要研制出更为安全、高效、廉价的新型疫苗。挖掘猪肺炎支原体抗原蛋白,是开发新型猪肺炎支原体疫苗的关键。猪肺炎支原体的细胞膜在其致病过程中发挥着重要作用,而目前MHP的膜蛋白中有很大部分蛋白的功能是未知的。鉴于此,本课题以猪肺炎支原体为研究对象,对其膜蛋白中具有免疫原性的蛋白进行了筛选,旨在找到猪肺炎支原体的免疫优势蛋白,从而为开发亚单位疫苗和建立诊断方法奠定基础。具体研究内容如下：1.候选蛋白的确定运用生物信息学方法预测并分析了猪肺炎支原体168株全基因组695个CDS和目前已知的MHP免疫原性蛋白的特性,发现猪肺炎支原体已知免疫原性蛋白中,粘附蛋白P97,P102,P216和抗原蛋白P46,P65,P95均只有一个跨膜区,并且跨膜区位于蛋白的N端,而蛋白的C端暴露在膜外。综合考虑蛋白的大小和进行密码子突变的可操作性,选定了34个只有一个跨膜区且跨膜区在N端的膜蛋白为研究对象。2.候选蛋白的原核表达通过对34个候选蛋白基因的分析,发现其中30个基因中存在TGA编码色氨酸的现象,通过SOE-PCR将这30个基因中编码色氨酸的TGA突变为了大肠杆菌中编码色氨酸的TGG,并将突变后的30个基因和不需要突变的4个基因分别克隆到原核表达载体pET28a中成功构建了各基因的原核表达质粒。将构建的表达质粒分别转化至BL21（DE3）或Rosetta （DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE证实其中26个候选蛋白获得高效表达。3.候选蛋白的反应原性分析以MHP人工感染28天猪阳性血清作为一抗,通过菌落原位免疫印迹和Western Blot检测发现34个候选蛋白中MHP168₃22, MHP168₃47, MHP168₃48,MHP168₃98, MHP168₆22和MHP168₆39这6个蛋白能与MHP感染猪阳性血清发生特异反应。进一步以MHP感染28天的猪阳性血清（n=27）和MHP灭活疫苗和弱毒疫苗免疫后不同时间的猪血清分别作为一抗,间接ELISA检测纯化的候选蛋白MHP168₃47, MHP168₃48, MHP168₆22, MHP168₆39和阳性对照P46蛋白与血清反应的情况。结果显示,候选蛋白MHP168₃47, MHP168₃48, MHP168₆39和P46蛋白均能与MHP人工感染28天的猪阳性血清反应,同阴性血清对照的结果相比,差异极显著（P<0.01）。MHP168₆22与MHP人工感染28天的猪阳性血清和阴性血清反应均很强烈,无显著差异。MHP168₃47, MHP168₃48, MHP168₆39和阳性对照P46蛋白均能与不同时期的弱毒疫苗免疫猪血清发生较强的反应,与PBS对照组相比,差异显著（P<0.05）,其中MHP168₃48的反应最强烈,可能是一个重要的保护性抗原。这4个蛋白均不与灭活疫苗免疫血清发生反应。4.候选蛋白的免疫原性分析将纯化的候选蛋白MHP168₃47, MHP168₃48, MHP168₆22和MHP168₆39和阳性对照P46蛋白免疫雌性BALB/c小鼠。以纯化的候选蛋白和4种猪肺炎支原体（N-1株,X-1株,MHP168株F116代和F374代）的菌体蛋白分别作抗原,通过间接ELISA和Western Blot检测候选蛋白免疫小鼠的血清抗体水平。结果显示：候选蛋白MHP168₆39, MHP168₃47和阳性对照P46蛋白均能诱导免疫小鼠产生较高水平的抗体,免疫原性较好。但只有MHP168₆39免疫的小鼠血清能与体外培养的猪肺炎支原体菌体蛋白发生特异性反应。本课题首次分析了猪肺炎支原体34个膜蛋白的免疫原性,并从中筛选到了4个可能的猪肺炎支原体免疫优势蛋白,为猪肺炎支原体抗原蛋白的研究提供了参考,也为猪肺炎支原体亚单位疫苗的开发和诊断方法的建立奠定了基础。