论文部分内容阅读
支气管哮喘是临床常见病、多发病,也是一种难以根治的疾病,由嗜酸性粒细胞、肥大细胞以及T淋巴细胞等多种炎性细胞共同参与的气道慢性炎症。这种炎症导致气道高反应性的增加,引起气道狭窄。临床表现为反复发作的气喘、咳嗽、胸中憋闷,甚至呼吸困难等症状,常在夜间和(或)清晨发作、加剧。该病时常出现可逆性气流受限。但是大多数患者可自行缓解或经治疗后减轻。属于传统医学中“哮证”、“哮吼”、“呷咳”等的范畴。本病的病因多种多样,发病机制也极其复杂,并未完全清楚,主要与气道炎症、气道高反应性和气道重塑有关。目前国际上已把气道重塑的研究提上重要议事日程。气道重塑的结构变化最终可导致气道高反应性、持续性的气流受阻,从而引起不可逆的肺功能损害。目前发现转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad信号通路是导致形成支气管哮喘气道重塑的重要信号转导机制之一。已有研究表明TGF-β1在气道重塑中发挥重要作用,其表达与成纤维细胞数量、支气管基底膜厚度以及哮喘发作的严重程度呈正相关。电针刺激背三针可降低气道重塑豚鼠模型支气管肺组织中转化生化因子β1蛋白表达。在TGF-β1的信号转导过程中,Smad3蛋白起正调节作用,促进其生物学表达活性,因此可促进气道重塑的发生发展。本课题选择Smad3作为TGF-β/Smad通路的下游信号调节蛋白,观察针刺对于哮喘气道重塑模型中对此信号通路的调控作用,探讨电针背三针治疗支气管哮喘的分子机制,为其临床应用推广提供深入的理论依据。目的：通过观察电针背三针(双侧大杼、风门、肺俞)对哮喘大鼠气道重塑模型TGF-p1(转化生长因子-β1)和Smad3蛋白及mRNA表达的影响,探讨电针背三针治疗支气管哮喘的作用和分子机制。方法：将SPF级SD雄性大鼠(共44只),随机分组为电针组(A)12只、地塞米松组(B)12只、模型组(C)10只、空白组(D)10只,共四组。除了空白组不做任何干预措施,其余各组大鼠均采用OVA(鸡卵白蛋白)加氢氧化铝佐剂腹腔注射1ml,其中含卵清白蛋白100mg,氢氧化铝100mg,致敏2次,周期为两周。第15天开始再用1%OVA进入雾化吸入激发,周期为6周,从而建立哮喘模型。地塞米松组在每次雾化前半小时给予地塞米松0.5mg/kg进行腹腔注射治疗。电针组在雾化激发前进行,穴取大杼、风门、肺俞,分别位于第1、2、3胸椎旁开7mm处,针刺方向与脊柱方向夹45°向头部方向进行斜刺,进针约3mm后,捻转行针约1分钟,之后接通电流刺激,波形选择疏密波,频率是16次／min,时间为15分钟,电针强度以大鼠能安静耐受并以手触碰针具可感受跳动为度。治疗隔日一次,至实验第8周末。在末次治疗干预结束后,将各组SD大鼠称重,按体重以3.5ml/kg的剂量给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。之后皮肤消毒,打开胸腔,进行心脏灌注。再取左肺组织,石蜡包埋、切片,进行HE染色和免疫组化检测,并用Image-Pro Plus图像分析软件检测平滑肌横断面标化面积以及支气管内管壁横断面标化面积。同时另取右肺组织,用4℃生理盐水漂洗血迹后放入2ml冻存管中,放置于-70℃低温保存,待用于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和Smad3的基因表达水平。结果：1.一般情况及行为学观察：模型组在每次进行OVA雾化吸入激发之后,精神较差,点头运动,呼吸加快,偶尔可见喷嚏,表现烦躁,抓耳挠腮,大小便增多等症状,电针组与地塞米松组则症状较轻,雾化激发后也会出现皮毛光色度下降、松散,呼吸频率加快、喷嚏及点头运动,而且地塞米松组出现体重增加不明显,形体消瘦等现象。2.肺组织形态病理学改变：模型组的支气管上皮细胞脱落并且出现杯状细胞数目增多,粘膜水肿,气道粘膜层、粘膜下层和血管周围组织均有炎性细胞浸润,其中以嗜酸粒细胞、淋巴细胞及浆细胞为主,平滑肌增厚、管腔狭窄闭塞等。而电针组与地塞米松组虽然也出现粘膜水肿、炎细胞浸润、平滑肌增厚等,但是程度都相对较轻。3.光学显微镜下肺组织气道形态学指标的改变：根据图像采集软件的分析结果可知,与空白组相比较,电针组、地塞米松组以及模型组的平滑肌横断面的标化后面积(WAm/Pbm)、支气管内管壁横断面标化后面积(WAi/Pbm)均有提高,具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,电针组与地塞米松组均有降低,具有统计学意义(P<0.05)。电针组与地塞米松组相比较,无统计学意义(P>0.05)。4.肺组织TGF-β1蛋白表达根据免疫组化结果可知,与空白组相比较,电针组、地塞米松组以及模型组的TGF-β1蛋白表达量均有提高,具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,电针组与地塞米松组的蛋白表达均有降低,具有统计学意义(P<0.05)。电针组与地塞米松组相比较,无统计学意义(P>0.05)。5.肺组织TGF-β1基因表达根据qRT-PCR的结果可得知,以空白组的表达作为参照,模型组、电针组以及地塞米松组的TGF-β1mRNA相对表达量均有提升,分别与空白组相比较均有显著差异(P<0.05)。与模型组相比较,电针组和地塞米松组的TGF-β1mRNA均有降低,有统计学意义(P<0.05)。而电针组与地塞米松组相比较,无统计学意义(P>0.05)。6.肺组织下游信号转导因子P-Smad3的蛋白表达根据免疫组化结果可知,与空白组相比较,电针组、地塞米松组以及模型组的P-Smad3蛋白表达量均有提高,具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,电针组与地塞米松组的蛋白表达均有降低,具有统计学意义(P<0.05)。电针组与地塞米松组相比较,无统计学意义(P>0.05)。7.肺组织下游信号转导因子Smad3的基因表达根据qRT-PCR的结果可得知,以空白组的表达作为参照,模型组、电针组以及地塞米松组的Smad3mRNA相对表达量均有提升,分别与空白组相比较均有显著差异(P<0.05)。与模型组相比较,电针组和地塞米松组的Smad3mRNA均有降低,有统计学意义(P<0.05)。而电针组与地塞米松组相比较,无统计学意义(P>0.05)。结论：1.与空白组相比较,模型组的气道形态学参数——平滑肌横断面的标化面积和支气管内管壁横断面标化面积均有升高,有统计学意义,说明造模成功,造模方法可行。经过治疗之后均下调,具有统计学意义,说明两种治疗方法均降低气道形态学参数值,从而减轻气道重塑的程度。但是电针组以及地塞米松组与空白组比较仍有统计学意义,说明这两种治疗方法并不能将气道重塑的程度恢复到正常。同时电针组与地塞米松组相比较效果相仿,对比之后无统计学意义。2.与空白组相比较,模型组的TGF-β1的蛋白以及mRNA均有提高。经过治疗以后,电针组和地塞米松组的TGF-β1的蛋白以及mRNA均有下降,说明这两种治疗方法都能降低TGF-β1的表达,从而抑制此信号通路的传导,达到抑制气道重塑的作用。但是电针组和地塞米松组与空白组比较仍有统计学意义,说明这两种干预手段都未能将降低至正常大鼠的范围。同时,电针组与地塞米松组相比较而言,无统计学意义,说明两种方法能取得类似的治疗效果。3.与空白组相比较,模型组的Smad3的蛋白以及mRNA均有提升,经过治疗以后,电针组和地塞米松组的Smad3的蛋白以及mRNA均有下调,说明这两种治疗方法都能降低Smad3的表达,从而抑制此信号通路的传导,达到抑制气道重塑的作用。但是电针组和地塞米松组与空白组比较之后仍具有统计学意义,说明这两种干预手段都未能将降低至正常大鼠的范围。同时,电针组与地塞米松组相比较而言,无统计学意义,说明两种方法能取得类似的治疗效果。综上结果显示,电针背三针可通过降低TGF-β1以及Smad3的蛋白和基因表达量,抑制TGF-β1/Smad3的信号路通的传导,从而达到改善气道重塑,缓解哮喘症状的目的。