论文部分内容阅读
一、研究背景我国是肺癌发生率和死亡率最高的国家之一。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占3/4,是主要病理类型。近年来,随着基础研究和临床随机对照研究的不断深入,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)已经成为NSCLC的重要靶点。靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)的出现和应用不仅为NSCLC患者带来了更长的生存时间,同时也大大提高了患者的生存质量。然而,随之而来的EGFR-TKIs继发性耐药这一棘手问题也困扰着广大临床工作者。其机制目前已较明确的有c-met扩增、T790M突变和原突变外显子二次突变等,而IGF-1R的扩增在NSCLC耐药中的作用,近来也越来越受到关注。IGF-1R扩增机制如何?有何调控因素等问题至今仍未得到充分解释。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)是近年来研究较广泛和深入的一类小的非编码RNA,它参与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及耐药等多步骤多过程,在多种类型肿瘤发病中分别发挥促癌或抑癌的作用。课题组前期研究发现,NSCLC中mi R-223表达降低;应用生物信息学及双荧光素酶实验发现胰岛素样生长因子-1受体(Insulin like growth factor 1 receptor,IGF-1R)是mi R-223的靶基因之一。既然在NSCLC EGFR-TKIs治疗耐药中有IGF-1R扩增机制参与,那么可以推测,miR-223可能通过调控IGF-1R信号通路而在NSCLC EGFR-TKIs治疗耐药中发挥重要作用。基于以上设想,本实验采用课题组前期诱导的耐厄洛替尼PC-9细胞(PC-9/ER细胞)及其亲本PC-9肺腺癌细胞为研究对象,探讨IGF-1R在NSCLC EGFR-TKIs靶向治疗耐药中的作用及其调控机制。二、研究目的在细胞水平及裸鼠移植瘤模型中研究IGF-1R在NSCLC细胞EGFR-TKIs耐药的机制,以及mi R-223在这一过程中的调控作用。三、研究方法1.稳定培养和传代PC-9/ER细胞,并与亲本PC-9肺腺癌细胞比较,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测PC-9/ER的耐药性。2.应用慢病毒转染法构建mi R-223过表达PC-9/ER细胞(PC-9/ER-mi R-223)及对照空载体PC-9/ER细胞(PC-9/ER-EV)。3.应用流式细胞术根据GFP荧光纯化转染细胞。4.应用流式细胞术检测PC-9/ER-mi R-223细胞及PC-9/ER-EV细胞在1μM厄洛替尼作用48h后的凋亡率。5.检测PC-9细胞、PC-9/ER细胞、PC-9/ER-mi R-223细胞及PC-9/ER-EV细胞中IGF-1R的m RNA及蛋白表达水平。6.利用IGF-1激动IGF-1R表达,观察其最佳激动作用的浓度及时间。7.Western blot方法检测PC-9细胞、PC-9/ER细胞、PC-9/ER-mi R-223细胞及PC-9/ER-EV细胞中IGF-1R/AKT/S6信号通路表达水平。8.构建裸鼠成瘤模型,观察各组裸鼠移植瘤体积大小及生存情况。四、研究结果1.稳定培养和传代PC-9细胞系。2.成功构建慢病毒过表达mi R-223过表达载体,稳定转染PC-9/ER细胞。3.应用流式细胞术成功分选出携带GFP荧光的PC-9/ER-mi R-223细胞及PC-9/ER-EV细胞,阳性率分别为95.6%和97%,荧光显微镜下观察其形态及生长情况,发现其形态方圆,成簇生长,呈绿色荧光。4.q RT-PCR方法检测PC-9/ER细胞转染mi R-223前后m RNA水平表达差异,结果显示转染组较对照组升高约16倍(p<0.05)。5.流式细胞术检测PC-9/ER-mi R-223组细胞凋亡率(18.92±2.123)是PC-9/ER-EV组(11.13±1.127%)的1.7倍(p<0.05)。6.CCK-8法检测PC-9、PC-9/ER、PC-9/ER-mi R-223、PC-9/ER-EV组细胞的IC50分别为0.25,5.16,1.19和5.29μM(p<0.05)。7.PC-9/ER细胞中IGF-1R m RNA水平是其亲本细胞PC-9的2.85倍(p<0.05),蛋白水平是PC-9的1.75倍(p<0.05)。8.PC-9/ER-mi R-223细胞中IGF-1R m RNA水平较其对照组PC-9/ER-EV细胞降低了43%(p<0.05),蛋白水平较对照组降低了34%(p<0.05)。9.IGF-1R及其下游分子AKT、S6在PC-9/ER中过表达,而过表达的mi R-223可靶向抑制IGF-1R/AKT/S6信号通路,且其抑制作用可被外源性IGF-1恢复。10.体外实验中,PC-9/ER组瘤体大小明显大于PC-9组(p<0.05),PC-9/ERmi R-223组明显小于PC-9/ER-EV组(p<0.05),循环中高水平IGF-1是生存降低的相关因素。五、结论IGF-1R过表达细胞株对厄洛替尼敏感性明显降低,而上调mi R-223表达可靶向抑制IGF-1R/AKT/S6信号通路,诱导耐药细胞凋亡,增加PC-9/ER细胞对厄洛替尼敏感性。