氢氰酸(HCN)和氯化氰(CNCl)是外军重点装备的全身中毒性毒剂,因分子中都含有氰根,故又称之为氰类毒剂。它们的毒性大、吸收迅速、防护困难,是典型的速杀性战剂。除HCN和CNCl外,属于氰类的还有无机的氰化钠、氰化钾等,都是剧毒的化工原料,平时的工农业生产中也可能由于泄露而引起人畜中毒。有机氰和植物中存在的氰类化合物也能对机体产生毒害作用。因此,氰类毒物中毒的防治是军事预防医学的重要任务。氰化物中毒后迅速出现缺氧、窒息、惊厥等中毒症状,来势凶猛、发展迅速,可在数分钟至数十分钟内死于呼吸、循环衰竭。氰化物进入机体后能迅速离解出氰根离子(CN-),能阻断细胞呼吸和氧化磷酸化,对细胞线粒体呼吸链末端氧化酶产生抑制作用,引起组织中毒性缺氧,进而细胞内生物氧化发生一系列变化,造成“内呼吸”障碍。一般将海拔高度大于3 000m的地区成为高原。低压低氧(习惯上称作高原缺氧)是高原地区的主要环境特征。部分人在这种环境下会出现明显的症状和体征。而超过这个高度时,其生理、生化和解剖等方面的改变就会变得越来越明显[1]。我国是一个高原地区面积广阔的国家,仅青藏高原的面积就达到250万平方公里。高原地区多与他国相邻,边境漫长,有重要的军事战略地位。当高原缺氧复合NaCN中毒时,缺氧和NaCN中毒这“内”、“外”两种缺氧因素同时作用机体,将对机体产生双重缺氧的联合打击。因此,对缺氧复合氰化物(NaCN)中毒的研究对我国的国防保障和未来的战争胜负都会产生极其重要的影响。急性缺氧对机体的血压(SP)、心率(HR)的影响已有相关报道。有多篇文献提出,急性低压缺氧大鼠心室收缩功能指标如左室收缩压(LVSP),左室压力最大上升速率(+dP/dtmax)等均显著降低。心肌细胞缺氧不仅是严重创伤后心功能衰竭的重要原因,也是启动和诱发其它脏器损伤形成多脏器功能不全/衰竭的重要始动因素[2]。有研究发现,在高原缺氧条件下化学战剂毒性增强,对心功能损害效应加重,引起心率失常、心肌收缩力减弱等心脏功能异常变化[3]。目前,国内外对缺氧复合NaCN中毒所产生的联合效应对大鼠心脏结构和功能影响研究甚少,对药物预防救治效果亦未见有关评价方面的报道。心脏是对缺氧极为敏感的器官。有研究表明,单纯缺氧和单纯NaCN中毒均可明显导致心肌细胞凋亡(Apoptosis),缺氧导致细胞死亡的主要方式是通过诱导细胞凋亡而产生的。在采用大鼠离体心肌细胞培养后、给予缺氧/复氧处理的实验研究中,发现了心肌细胞在持续较长时间的缺氧而再复氧时,细胞损伤现象严重,与曾经研究过的在体动物心肌细胞缺血/再灌注损伤情况一致。在缺氧/复氧损伤组中,流式细胞仪PI染色法的DNA分析直方图上,低于G1期的细胞数增多,明显高于其他各组,说明凋亡的细胞存在较多。透射电镜可见缺氧/复氧损伤组心肌细胞损伤严重,可有明显的凋亡前期、凋亡阶段或凋亡后期的改变,同时心肌细胞凋亡数目也明显增加,支持复氧(再灌注)损伤是心肌细胞凋亡的重要诱发因素。认为缺氧/复氧可加重心肌细胞损伤,伴着心肌细胞凋亡的增加;细胞内钙离子过多可能是触发心肌细胞凋亡的因素;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)可减少自由基的生成、降低心肌细胞凋亡的发生和缺氧预处理具有抗心肌细胞损伤和减轻心肌细胞凋亡的作用,均有可能是通过降低细胞内钙离子浓度而起作用的[4-6]。Fliss[7]等在在体动物模型研究中也发现了细胞凋亡是心肌再灌注损伤的特征之一,再灌注损伤可加速不可逆转的细胞凋亡。Musat-Marcu等[8]在体外灌注大鼠心脏发现其早期即可发生心肌细胞凋亡,且在抑制凋亡后伴随着心功能的恢复,提示心肌细胞凋亡参与了心功能的衰减。细胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)及细胞凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF)正常时分别位于线粒体内膜和线粒体膜间隙。缺血/再灌注(MI/R)时,PT孔受损而开放,Cyt C及AIF被释放入胞浆。Cyt C与胞浆中的凋亡激活因子-1(apoptosis- activating factor-1, Apaf-1)结合,依次激活半胱酸蛋白酶家族中的Caspase-9、Caspase-3而启动凋亡通路,活化的Caspase-3可以作用于胞质中的细胞骨架蛋白,或作用于细胞核中的DNA,引发细胞凋亡,这是线粒体caspase依赖性凋亡途径。而AIF经PT孔被释放入胞浆,其将易位入核,激活内源性核酸内切酶将染色体切割为180-200bp整数倍的DNA片断,同时加速Cyt C的释放,进一步促进细胞凋亡,这是线粒体caspase非依赖性凋亡途径。可见,线粒体caspase依赖性和caspase非依赖性这两条凋亡途径在心肌细胞凋亡中发挥重要作用。缺氧预适应( hypoxic preconditioning, HPC),并可将其界定为“预先短时间非致死性重复缺血/缺氧后,机体组织细胞获得对随后长时间致死性缺血/缺氧损伤的高度耐受性”。缺氧预处理对心肌细胞可以产生预适应现象,缺氧预适应迄今为止被认为是最强有力的一种心肌内源性保护措施[9,10]。人参皂苷(saponins of panax ginseng, SPG)能对抗氧自由基对心脏的损伤,保持心肌细胞膜的完整性,改善急性心肌缺血时心肌舒张功能,还能对抗心肌缺血所致心肌不可逆坏死,使SOD活性升高,心肌释放磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpy- ruvate carboxykinase, PCK)减少。人参总皂苷(total saponins of Panax Ginseng, TSPG)对缺血再灌注损伤中的细胞坏死和细胞凋亡均有显著的保护作用[11-14]。人参皂苷尤其是Re可能具有阻滞K+通道的作用,可使离体豚鼠乳头状肌细胞动作电位时程和有效不应期均延长,人参皂苷抗心律失常的作用[15]。人参皂苷抗心肌缺血等作用研究表明,人参皂苷能对抗氧自由基对心脏的损伤,保持心肌细胞膜的完整性,改善急性心肌缺血时心肌舒张功能,还能对抗心肌缺血所致心肌不可逆坏死,使SOD活性升高,心肌释放PCK减少。侯明晓等利用体外培养的心肌细胞缺血再灌注损伤的模型的结果表明:TSPG对缺血再灌注损伤中的细胞坏死和细胞凋亡均有显著的保护作用[16]。Scott等研究发现,人参皂苷Rb1可抑制心肌细胞的收缩,有助于减少心肌的耗氧量[17]。自由基亦可损伤血管内皮细胞,引起动脉粥样硬化、高血压等心脑血管疾病。有实验表明,人参皂苷可降低过氧化物丙二醛的含量,从而减轻血管内皮细胞损伤。而牛磺酸(Taurine, Tau)能清除氧自由基、保护细胞膜、使心肌酶和肝酶释放减少、具有极强抗氧化能力。它也能调节细胞内钙的稳态,减少肢体缺血再灌注时钙离子内流,而且中性粒细胞呼吸爆发产生大量过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2),与CL结合产生难以清除的强氧化剂-次氯酸,牛磺酸可与次氯酸结合,形成稳定的弱氧化剂-氯胺牛磺酸,从而除次氯酸对细胞的破坏作用。因此显示牛磺酸可纠正肢体缺血再灌注后远隔器官损伤[18]。长疗程应用牛磺酸在降低血压和逆转心肌肥厚的同时,也使高血压大鼠心肌细胞凋亡减少,并能降低大鼠心肌AngⅡ含量和ACE活性。因此,我们认为,长疗程牛磺酸治疗可抑制高血压大鼠心肌细胞凋亡和逆转心肌肥厚,上述作用可能与药物拮抗组织局部AngⅡ的生成有关。牛磺酸还具有抑制心肌细胞凋亡的作用,可能与其调控凋亡相关基因Fas、Bax和Bcl-2的蛋白表达有关。牛磺酸可以有效保护心肌细胞而避免发生心脏畸形,同时有降低血压[19,20]。血液供应和血氧含量是心脏功能正常的先决条件,因此,任何引起血液中氧含量降低或心肌供血不足的有害因素都可能导致心脏功能异常。那么,缺氧环境氰化物中毒对心脏功能将会产生何种影响?由此带来的心脏损伤其机制如何?线粒体caspase依赖性和caspase非依赖性这两条凋亡途径在缺氧环境氰化物中毒诱导大鼠心肌细胞凋亡中有何种作用?缺氧预适应、人参皂苷和牛磺酸等干预措施对大鼠缺氧环境氰化物中毒有无效果?这些问题迄今未见研究报道。本课题基于上述两种情况,在前期工作的基础上,采用实验动物研究和体外细胞培养研究相结合的方法,建立缺氧复合NaCN中毒的动物模型和NaCN染毒的细胞模型,通过观察模拟高原环境缺氧复合NaCN中毒对大鼠心脏的影响、检测SPG等干预措施对缺氧复合NaCN中毒大鼠心脏保护作用、观测心肌细胞NaCN染毒后细胞凋亡情况,以及定量分析上述情况下线粒体caspase依赖性和caspase非依赖性这两条凋亡途径中Cyt C、caspase-3和AIF等因子的表达,来探讨模拟缺氧条件下NaCN中毒后心功能改变的特点和心肌细胞凋亡的特性,为今后缺氧性NaCN中毒的预防救治措施的研究提供重要的理论基4础。最终为制定缺氧条件下复合NaCN中毒的预防和救治方案提供实验和理论依据。方法:1.检测有无干预措施情况下缺氧复合NaCN中毒后对大鼠心脏结构和功能影响,包括血流动力学、心电图、心肌酶谱、心肌病理切片光镜电镜观测等;2.建立体外SD乳鼠心肌细胞NaCN染毒模型,检测急性NaCN染毒后心肌细胞是否存在凋亡情况;3.定量分析有无干预措施情况下心肌细胞缺氧复合NaCN中毒后Cyt C、caspase-3和AIF表达,分析线粒体caspase依赖性和caspase非依赖性这两条凋亡途径在缺氧复合NaCN中毒引起心肌细胞凋亡中的特点;结果:一、人参皂苷等干预措施对缺氧和NaCN中毒大鼠心脏的保护作用1.平原实验组大鼠NaCN中毒后,血流动力学发生改变:HR、mLVSP、+dP/dtmax等指标均较中毒前出现显著下降(P<0.01),T波振幅则出现显著上升(P<0.01),30min后逐渐向正常值恢复。2.高原实验组大鼠NaCN中毒后,血流动力学改变比平原实验组更为明显:HR、mLVSP、+dP/dtmax等指标均较中毒前出现显著下降(P<0.01),T波振幅则出现显著上升(P<0.01),40min后逐渐向正常值恢复,但恢复程度和效果较平原实验组差。3.平原实验组大鼠NaCN中毒后,Cyt C活性显著降低(P<0.01)。中毒2h后,Cyt C活性有明显的恢复(P<0.01)。4.高原实验组大鼠在NaCN中毒后,Cyt C的活性显著低于平原实验组(P<0.01);中毒2h后也有一定程度恢复,但与平原实验组比较恢复更慢(P<0.01)。5.平原和高原实验组大鼠NaCN中毒后均出现明显的心肌酶谱(AST、LDH、CK、CK-MB)变化,高原实验组大鼠的心肌酶谱改变比平原实验组大鼠更显著(P<0.01),并且恢复缓慢。其中,LDH变化最为显著。6.平原实验组大鼠中毒后心肌组织损伤逐渐加重,至2h后最为严重,间质有腔隙形成,出现纤维退变,横纹不清,弥漫性充血、水肿变性,少数心肌有断裂,横纹消失;中毒6h时有明显的恢复。7.高原实验组大鼠心肌组织中毒前即见充血、水肿变性、局灶性炎症细胞等变化。NaCN中毒后心肌损伤加重,出现严重水肿变性,弥漫性细胞肿胀,胞质模糊,并有水肿囊出现,细胞变性,间质血管充血。中毒6h时,高原实验组大鼠心肌组织损伤并无明显的恢复。8.平原实验组大鼠中毒2h后出现线粒体轻微水肿,灶性溶解,内质网扩张,线粒体部分嵴和膜融合或消失等现象。9.高原对照组大鼠超微结构也出现轻微损伤,心肌间质有轻微水肿,线粒体略有肿胀;高原NaCN中毒组大鼠线粒体则肿胀明显,有小量的嵴和膜融合或消失,心肌间质水肿,肌节排列稍紊乱,核旁水肿处线粒体大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网有脱颗粒现象;损伤程度明显重于平原实验组大鼠。10. HPC和SPG、Tau灌胃干预后,对NaCN中毒和高原缺氧复合NaCN中毒引起的大鼠血流动力学改变有明显的干预作用,HR、mLVSP、+dP/dtmax、T波振幅等指标均较未干预组变化程度小,恢复效果更明显,且有统计学意义。11. HPC干预后的大鼠NaCN中毒后Cyt C活性也出现显著降低(P<0.01),至2h时有所恢复,效果好于高原缺氧复合NaCN中毒大鼠(P<0.05)。二、NaCN对SD乳鼠原代心肌细胞的凋亡作用1.建立了NaCN染毒SD乳鼠心肌细胞模型;2.测定出SD乳鼠心肌细胞NaCN染毒的IC50值:正常条件下IC50值为87.85μmol·L-1。3.以IC50剂量的NaCN染毒后,SD乳鼠心肌细胞出现凋亡。凋亡细胞的细胞核由于染色质浓集而呈现亮蓝色,呈分叶、碎片状等。三、caspase依赖/非依赖性途径在大鼠心脏损伤中的作用研究1.大鼠缺氧复合/或NaCN中毒30min后,心肌组织胞浆Cyt C、caspase-3蛋白表达和mRNA表达均上调;2.大鼠缺氧复合/或NaCN中毒30min后,心肌组织胞浆AIF蛋白表达上调,而AIF mRNA表达对NaCN染毒诱导却并不敏感;3. Tau、SPG干预对抑制大鼠缺氧复合/或NaCN中毒30min后心肌组织胞浆Cyt C、caspase-3和AIF蛋白表达以及Cyt C、caspase-3 mRNA表达上调有明显作用,对AIF mRNA表达无明显作用。结论:1.缺氧复合NaCN中毒大鼠血流动力学HR、mLVSP、+dP/dtmax等指标均显著下降,T波振幅显著增高。相对于单纯的缺氧和单纯的NaCN中毒,两种因素同时作用所引起的心脏功能损伤,特别是心脏的收缩能力的损伤更加明显;2.缺氧复合NaCN中毒大鼠的血液生化指标,如心肌酶谱(AST、LDH、CK、CK-MB)的变化也更为明显,Cyt C活性下降也更为显著。表明两种因素作用下大鼠的心脏生化代谢变化很大,加重心脏功能的紊乱;3.病理检测结果表明,缺氧复合NaCN中毒后大鼠心肌组织的结构损伤更为严重,超微结构的病理改变更加明显,特别是NaCN中毒的靶细胞器-线粒体的损伤,这可能是引起心肌细胞凋亡的最主要原因;4. HPC、SPG和Tau等干预措施,对缺氧复合NaCN中毒大鼠心脏功能的恢复和维持Cyt C的活性均有一定的效果。可考虑将HPC、SPG和Tau等列入缺氧复合NaCN中毒防护措施的筛选;5.通过建立的体外SD乳鼠心肌细胞NaCN染毒模型,发现经IC50剂量NaCN染毒SD乳鼠原代心肌细胞凋亡。提示细胞凋亡可能在缺氧复合NaCN中毒心脏损伤中发挥作用;6.大鼠缺氧复合/或NaCN中毒30min后心肌组织胞浆Cyt C、caspase-3蛋白表达和mRNA表达上调,线粒体caspase依赖途径导致的心肌细胞凋亡十分明显,寻找阻止线粒体caspase依赖途径心肌细胞凋亡的措施可能会对缺氧复合NaCN中毒的预防和治疗带来一定的效果;7. Tau、SPG干预,对抑制大鼠缺氧和/或NaCN中毒心肌组织胞浆Cyt C、caspase-3和AIF蛋白表达以及Cyt C、caspase-3 mRNA表达上调有明显作用,提示Tau、SPG可作为预防线粒体途径引起心肌细胞凋亡的筛选措施;8.大鼠NaCN中毒30min后,心肌组织胞浆AIF蛋白表达虽然出现上调,但AIF mRNA表达变化却并不明显;AIF mRNA表达对缺氧的敏感程度强于对NaCN中毒,提示NaCN中毒后线粒体非caspase依赖途径引起心肌细胞凋亡的机制并不同于caspase依赖途径,缺氧、NaCN中毒引起心肌细胞凋亡可能存在不同的机制,值得深入研究。