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[研究背景]
炎症性肠病（inflammatoryboweldisease,IBD）包括克罗恩病（crohndisease,CD）、溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）以及病理学不能确定为UC或CD的未定型结肠炎（indeterminatecolitis,IC），是一类与免疫调节异常相关且病因未明的慢性非特异性肠道炎性疾病，病情反复，迁延不愈[1-3]。近年来，IBD的发病率逐年升高[1-2]，环境因素、基因遗传、感染和免疫功能失调等多因素参与其发病。IBD患者以临床反复发作的腹泻、腹痛，体重下降以及血便等症状为主要表现，目前尚无有效彻底根治IBD的方案[1-2]。因此，急需更多的医学基础研究来揭示其发病机制，找到有效的临床治疗方案，从而改善IBD患者的预后及生活质量。
雌激素是体内重要的类固醇激素，除了调控生殖系统和代谢外，还对中枢神经、心血管、消化等系统有重要的调节作用[4]。内源性雌激素主要包括雌酮(estrone,E1)、雌二醇(estradiol,E2)、雌三醇(estriol,E3)，其中以E2的生物活性最强，在体内起主要作用。雌激素通过与其受体结合激活下游信号，调控各种相关基因的表达，进而发挥强大的生物学效应。研究显示，许多炎症性疾病都受到雌激素的调控[5-10]。IBD患病率存在性别差异[11-15]，而雌激素可影响其发生发展，但具体机制不清。雌激素在IBD中的作用尚存在争议，有研究显示，雌激素受体激活后具有抗炎抗损伤功能，对IBD起到保护性作用[16-22]，也有研究表明，雌激素能使IBD病情恶化加剧[2,14-15]。因此，雌激素在IBD中的作用及其机制有待进一步的研究。
髓源性抑制细胞(Myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs)是在病理情况下异常扩增的一群成分复杂的异质性髓系前体细胞，在肿瘤、炎症以及自身免疫性疾病的发生发展过程中起着重要的调节作用[23-24]。在病理状态下，特别是肿瘤发生时，骨髓腔受异常信号持续刺激，大量非成熟髓细胞聚集于肿瘤和外周淋巴器官，MDSCs分化为成熟髓细胞的能力降低。MDSCs既可以通过与T细胞直接接触对其增殖及功能起到明显的抑制作用[23-25]，也可以通过过多产生活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）、一氧化氮（Nitricoxide,NO）、精氨酸酶-1（Arginase-1,ARG-1）、抑制性细胞因子等途径增强其免疫抑制功能[26]。MDSCs的减少及功能受损均可引发过度炎症反应，诱发IBD[27]。研究发现MDSCs在IBD活动期明显增加，但MDSCs在IBD发病中的具体作用和机制仍有待进一步研究。
本研究第一部分的内容为小鼠炎症性肠病模型的建立，目的在于建立良好的动物模型，为应用此模型进行后续的研究打下基础，并通过动物模型揭示MDSCs与IBD的之间的关联以及外源性雌激素对IBD中MDSCs的作用效果。本研究第二部分的内容为雌激素对MDSCs的作用机制研究，详细探究雌激素通过ERα促进STAT3及NF-κB磷酸化，上调MDSCs中CyclinD1、iNOS蛋白的表达量，进而影响到MDSCs的增殖及功能状态改变的信号机制。
课题的创新之处在于从MDSCs这一新角度出发，揭示雌激素调控免疫反应，抑制IBD的作用及机制，有望为开发新型的IBD治疗靶点提供理论依据。
[研究目的]
本课题旨在探究雌激素通过ERα促进MDSCs增殖对IBD起保护性作用的可能机制，并进一步在动物模型上确认MDSCs在E2缓解IBD症状中的作用；通过体外细胞实验明确E2对MDSCs增殖及功能的影响，为雌激素、MDSCs能否成为临床IBD治疗的新靶点提供实验依据。
[方法和结果]
本课题研究中，我们用二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonicacid,DNB）灌肠诱导成功建立小鼠急性IBD模型，对小鼠脾脏细胞进行流式分析，结果显示IBD模型小鼠脾脏中CD4+T、CD8+T细胞比野生型小鼠明显增多。HE染色法对小鼠致炎结肠进行组织学分析，发现与WT小鼠相比，IBD模型小鼠结肠病变部位存在明显的炎症症状，腺上皮细胞坏死、腺体破坏，核分裂增多。流式细胞术检测小鼠骨髓中MDSCs含量，结果显示与WT小鼠相比，IBD模型小鼠骨髓MDSCs、G-MDSCs显著增多，M-MDSCs反而减少。对卵巢去势的（Ovariectomized,OVX）小鼠IBD模型进行流式细胞术检测，发现与Sham模型小鼠相比，OVX模型小鼠骨髓中MDSCs降低，而补充外源性E2可以显著促进OVX模型小鼠骨髓中MDSCs的增殖。免疫印迹和PCR检测到体外用细胞因子GM-CSF和IL-6进行诱导培养3-5天的MDSCs上表达ERα蛋白和mRNA。体外培养的MDSCs分别用ERα选择性阻断剂MPP和ERβ选择性剂PHTPP处理，流式分析显示，MPP可以显著抑制MDSCs扩增而PHTPP不影响MDSCs数量。不同浓度的E2处理体外培养的MDSCs，免疫印迹结果显示信号通路介导E2上调MDSCs中CyclinD1、p-Stat3、iNOS、p-P65、p-Akt、p-mTOR等蛋白的表达水平被上调。
[结论]
通过DNB灌肠诱导可成功建立小鼠急性IBD模型，并应用于本课题研究。
雌激素能够通过ERα受体上调MDSCs胞内的STAT3信号通路及PI3K/Akt/NF-kB信号通路的磷酸化，促进MDSCs的增殖。这可能是其抑制肠道免疫炎症反应、缓解IBD发生发展的重要机制。
炎症性肠病（inflammatoryboweldisease,IBD）包括克罗恩病（crohndisease,CD）、溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）以及病理学不能确定为UC或CD的未定型结肠炎（indeterminatecolitis,IC），是一类与免疫调节异常相关且病因未明的慢性非特异性肠道炎性疾病，病情反复，迁延不愈[1-3]。近年来，IBD的发病率逐年升高[1-2]，环境因素、基因遗传、感染和免疫功能失调等多因素参与其发病。IBD患者以临床反复发作的腹泻、腹痛，体重下降以及血便等症状为主要表现，目前尚无有效彻底根治IBD的方案[1-2]。因此，急需更多的医学基础研究来揭示其发病机制，找到有效的临床治疗方案，从而改善IBD患者的预后及生活质量。
雌激素是体内重要的类固醇激素，除了调控生殖系统和代谢外，还对中枢神经、心血管、消化等系统有重要的调节作用[4]。内源性雌激素主要包括雌酮(estrone,E1)、雌二醇(estradiol,E2)、雌三醇(estriol,E3)，其中以E2的生物活性最强，在体内起主要作用。雌激素通过与其受体结合激活下游信号，调控各种相关基因的表达，进而发挥强大的生物学效应。研究显示，许多炎症性疾病都受到雌激素的调控[5-10]。IBD患病率存在性别差异[11-15]，而雌激素可影响其发生发展，但具体机制不清。雌激素在IBD中的作用尚存在争议，有研究显示，雌激素受体激活后具有抗炎抗损伤功能，对IBD起到保护性作用[16-22]，也有研究表明，雌激素能使IBD病情恶化加剧[2,14-15]。因此，雌激素在IBD中的作用及其机制有待进一步的研究。
髓源性抑制细胞(Myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs)是在病理情况下异常扩增的一群成分复杂的异质性髓系前体细胞，在肿瘤、炎症以及自身免疫性疾病的发生发展过程中起着重要的调节作用[23-24]。在病理状态下，特别是肿瘤发生时，骨髓腔受异常信号持续刺激，大量非成熟髓细胞聚集于肿瘤和外周淋巴器官，MDSCs分化为成熟髓细胞的能力降低。MDSCs既可以通过与T细胞直接接触对其增殖及功能起到明显的抑制作用[23-25]，也可以通过过多产生活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）、一氧化氮（Nitricoxide,NO）、精氨酸酶-1（Arginase-1,ARG-1）、抑制性细胞因子等途径增强其免疫抑制功能[26]。MDSCs的减少及功能受损均可引发过度炎症反应，诱发IBD[27]。研究发现MDSCs在IBD活动期明显增加，但MDSCs在IBD发病中的具体作用和机制仍有待进一步研究。
本研究第一部分的内容为小鼠炎症性肠病模型的建立，目的在于建立良好的动物模型，为应用此模型进行后续的研究打下基础，并通过动物模型揭示MDSCs与IBD的之间的关联以及外源性雌激素对IBD中MDSCs的作用效果。本研究第二部分的内容为雌激素对MDSCs的作用机制研究，详细探究雌激素通过ERα促进STAT3及NF-κB磷酸化，上调MDSCs中CyclinD1、iNOS蛋白的表达量，进而影响到MDSCs的增殖及功能状态改变的信号机制。
课题的创新之处在于从MDSCs这一新角度出发，揭示雌激素调控免疫反应，抑制IBD的作用及机制，有望为开发新型的IBD治疗靶点提供理论依据。
[研究目的]
本课题旨在探究雌激素通过ERα促进MDSCs增殖对IBD起保护性作用的可能机制，并进一步在动物模型上确认MDSCs在E2缓解IBD症状中的作用；通过体外细胞实验明确E2对MDSCs增殖及功能的影响，为雌激素、MDSCs能否成为临床IBD治疗的新靶点提供实验依据。
[方法和结果]
本课题研究中，我们用二硝基苯磺酸（dinitrobenzenesulfonicacid,DNB）灌肠诱导成功建立小鼠急性IBD模型，对小鼠脾脏细胞进行流式分析，结果显示IBD模型小鼠脾脏中CD4+T、CD8+T细胞比野生型小鼠明显增多。HE染色法对小鼠致炎结肠进行组织学分析，发现与WT小鼠相比，IBD模型小鼠结肠病变部位存在明显的炎症症状，腺上皮细胞坏死、腺体破坏，核分裂增多。流式细胞术检测小鼠骨髓中MDSCs含量，结果显示与WT小鼠相比，IBD模型小鼠骨髓MDSCs、G-MDSCs显著增多，M-MDSCs反而减少。对卵巢去势的（Ovariectomized,OVX）小鼠IBD模型进行流式细胞术检测，发现与Sham模型小鼠相比，OVX模型小鼠骨髓中MDSCs降低，而补充外源性E2可以显著促进OVX模型小鼠骨髓中MDSCs的增殖。免疫印迹和PCR检测到体外用细胞因子GM-CSF和IL-6进行诱导培养3-5天的MDSCs上表达ERα蛋白和mRNA。体外培养的MDSCs分别用ERα选择性阻断剂MPP和ERβ选择性剂PHTPP处理，流式分析显示，MPP可以显著抑制MDSCs扩增而PHTPP不影响MDSCs数量。不同浓度的E2处理体外培养的MDSCs，免疫印迹结果显示信号通路介导E2上调MDSCs中CyclinD1、p-Stat3、iNOS、p-P65、p-Akt、p-mTOR等蛋白的表达水平被上调。
[结论]
通过DNB灌肠诱导可成功建立小鼠急性IBD模型，并应用于本课题研究。
雌激素能够通过ERα受体上调MDSCs胞内的STAT3信号通路及PI3K/Akt/NF-kB信号通路的磷酸化，促进MDSCs的增殖。这可能是其抑制肠道免疫炎症反应、缓解IBD发生发展的重要机制。