研究背景丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染可导致75%-85%感染者发展为慢性肝病，是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病因，严重危害人类的健康和生命。全球HCV感染率约3.0%，即有1.7-2.0亿的HCV感染者；我国的HCV感染率约为2.5-4.9%，感染人数已超过3000万。HCV可经静脉吸毒、输血、性传播、垂直传播、或经破损的皮肤粘膜传播如手术、纹身、拔牙、共用卫生器具等。发达国家以静脉吸毒传播为主，我国早期以输血和血制品传播为主，在实行血液筛查HCV制度后，此传播途径大幅下降。但随着我国吸毒人群增多，经静脉吸毒感染HCV的比例增大。HCV基因型繁多，目前国内外常采用Simmonds命名法，将HCV分为6种基因型和80多种基因亚型。基因型分布有明显的地域差异性，la、lb、2a、2b、3a型呈全球广泛分布，其中1b型分布最广；中国以1b和2a型多见，其中以1b型为主，2a型主要分布在中国北部，3型主要分布在云南等西南地区，4型、5型报道罕见，6型主要见于香港、澳门及南方边境省份，6亚型最复杂，变异株最多，到目前为止，6型已发现有23个亚型。有报导广东地区献血员和静脉吸毒人群中，以1b和6a型为主，并发现新的6型变异株。而本地区丙型肝炎患者的HCV基型变化有待进一步研究。不同基因型的HCV对肝脏损伤程度不同，1b型对肝脏的损伤严重度大于其他基因型。目前多采用聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）α联合利巴韦林（RBV）进行抗病毒治疗，不同基因型感染者疗效不一，1、4型病毒应答率低于2、3型，因此，准确诊断HCV基因型对HCV抗病毒治疗方案选择及疗效判断至关重要。为了精准分型，国际上对HCV基因分型技术进行了长期研究。目前，HCV基因分型技术包括基因测序法、型特异性引物扩增法、探针杂交法、基因芯片法、限制性片段长度多态性分析（RELP）、异源分子迁移率分析法（HMA）等。对HCV全基因组测序是最准确的方法，但难度大、费时、成本高，临床上难以实行，而部分基因测序法相对简单易行，目前已将HCV基因NSB5区测序分型法视为“金标准”。但我们临床上常规采用国产商业试剂(探针杂交法)对HCV基因分型，此法只能分出1型与非1型，且准确率较低。鉴于基因分型方法存在的问题和广东地区HCV基因型的复杂性，为配合临床丙型肝炎诊疗的需求，本研究以广州地区丙型肝炎患者为主体，对其HCV基因相关问题进行了研究，包括临床切实可行的两种基因分型方法的准确性比较和HCV分子流行病学研究两部分内容。第一部分临床切实可行的两种基因分型法（部分基因测序法与探针杂交法）的准确性比较研究内容及目的比较临床常规使用的HCV部分基因测序法和探针杂交法对HCV基因分型的准确性，为临床选择HCV基因分型方法、基因型诊断和制定抗病毒治疗策略及HCV分子流行病学研究提供可靠依据。研究方法收集2012-2013年在广州市第八人民医院就诊的191例临床丙型肝炎患者，其血清标本已采用国产探针杂交法进行了HCV基因分型。以国际HCV基因库中HCV全基因序列代表株的分型结果为“金标准”，设计C区和NS5B区基因序列扩增引物，分别扩增HCV C区和NS5B区基因，基因产物的测序结果与“金标准”共建系统进化树进行基因分型，分型结果与患者的探针杂交法分型结果进行对比。研究结果1.从国际HCV基因库中共获得92个代表株，涵盖7个基因型、54个基因亚型和5个重组基因型。分别构建代表株的全基因、C区和NS5B区的系统进化树，结果显示，92个代表株的全基因序列分型结果与其C区和NS5B区基因分型结果一致。2.用HCV C区和NS5B区扩增引物分别检测191例临床丙型肝炎患者的HCV基因，结果显示两区均扩增成功的有171例，其中167例C区和NS5B区HCV基因分型结果一致。3.167例基因测序分型结果与患者的探针杂交法分型结果对比显示，总符合率为84.43%（141/167）。探针杂交法误检的26例中，23例6a型误检为1型；2例1b和1例1a型被误检为非1型。171例患者中另外4例（2.34%）的C区与NS5B区HCV分型结果不一致，其中3例C区分型为6a而NS5B区分型为1b，另外1例C区分型为1b而NS5B分型为6a，4例患者的探针杂交结果显示，2例与C区结果一致；另外2例与NS5B区结果一致。结论1.目前临床上常规使用的国产商业试剂（探针杂交法）误检率高，且易在1型和6型间出现误检。2.建立了更精确的基因分型法：C区和NS5B区基因同时测序可使分型结果更加准确，两区分型结果一致时可以取代HCV全基因测序分型，两区分型结果不一致时，提示可能存在混合株或重组株感染，需做进一步分析。第二部分广州地区丙型肝炎患者的HCV分子流行病学研究研究内容及目的研究广州地区丙型肝炎患者HCV基因型特点及其与患者年龄、性别、传播途径及HCV病毒载量的相关性，以便了解本地区丙肝临床HCV分子流行病学变化趋势及对临床预后的影响。研究方法收集2012-2013年在广州市第八人民医院就诊的207例HCV RAN阳性的丙型肝炎患者血清，分别提取病毒RNA，反转录生成cDNA。对其HCV C区和NS5B区基因序列进行RT-NPCR扩增，两区扩增成功的PCR产物进行基因测序，测序结果分别与相应的参照株序列比对，构建系统进化树，两区基因分型结果一致者确定HCV基因亚型，分析广州地区HCV基因型特点及传播途径。并采用SPSS13.0统计软件分析性别、年龄、HCV病毒载量与基因型的相关性。研究结果1.179例结果纳入分析207例标本分别进行HCV C区及NS5B区巢式PCR扩增，产物分别为401bp，375bp，目的条带清晰且单一，无非特异性杂带。有185例HCV C区和NS5B区都扩增成功，其中179例两区基因分型结果一致。2. HCV基因型特点1）179例HCV基因特点共检出1型、2型、3型、6型四种基因型和八种基因亚型，以1b和6a为主。各亚型所占比例为：1b型40.78﹪(73/179)，6a型27.37﹪(49/179)，3b型11.73﹪(21/179)，3a型8.94﹪(16/179)，2a型6.15﹪(11/179)，1a型3.91﹪(7/179)，2b型0.56﹪(1/179)，6n型0.56﹪(1/179)。未发现新的6型变异株。2）1b和6a型系统进化树特点1b株主要分为在A、B、C三簇，A簇与中国广泛流行1b株同源性高、B簇与中国中部及南部地区流行1b株同源性高；6a型株分为Ⅰ、Ⅱ两大簇，与广东地区献血人群及静脉吸毒人群中HCV6a型感染株同源性高。3.流行病学特点：1）传播途径患者主要通过静脉吸毒、输血和血制品感染HCV。静脉吸毒感染者中主要以6a型为主，占57.45%（27/47），其次为3a型，占21.28%（10/47）；通过输血和血制品感染者中主要以1b型为主，占78.95%（30/38）。2）性别6组基因亚型间患者的性别比例有明显统计学差异（P=0.002）。3）年龄6组基因亚型间患者年龄分布有统计学差异（P=0.007），2a型患者平均年龄最大（53.45±11.02岁），与其他组相比，均有统计学差异（均为P<0.05），而其他组两两比较均无统计学差异。4）病毒载量6组基因亚型间患者的病毒载量有统计学差异（P=0.000），1b型患者病毒载量平均水平最高（6.51±0.90log10IU/ml），与其他组相比，均有统计学差异（均为P<0.05），而其他组两两比较均无统计学差异。5)合并HIV感染患者特点179例患者中，有30例患者合并HIV感染，其中以6a型患者最多，达51.51%（17/33）。采用独立样本的t检验，比较单纯HCV与合并HIV感染者的HCV载量均值，结果显示，两组间无统计学差异（P=0.691）。结论：1.广州地区丙型肝炎患者HCV基因型存在多种亚型；以1b、6a、3型为主，1b型株包含中国大部分地区的1b型株，6a、3型已取代2a型分别成为第二、三主要流行基因型；未发现其他文献报道的或未曾发现的6型变异株。2.丙型肝炎患者性别比例、年龄、病毒载量在基因亚型上均有统计学差异，其中2a型平均年龄水平最高。1b型病毒载量最高，这与1b型比其他基因型有更强的致病性等报道是相符的。输血及血制品传播中以lb型为主，静脉吸毒传播中以6a型为主。3. HCV/HIV共感染者以6a型占主要，其病毒载量与单纯HCV感染者相比无统计学差异。