癌症是目前威胁人类生命健康的严重疾病之一,天然抗癌药物莱菔硫烷可以通过抑制Ⅰ相酶的代谢水平,把致癌物转化为非致癌物。硫代葡萄糖苷是莱菔硫烷的前体物质,通过黑芥子酶水解后可以生成莱菔硫烷。因此,硫代葡萄糖苷是莱菔硫烷生产过程中必不可少的物质之一。本课题旨在利用合成生物学的方法,以大肠杆菌为底盘生物异源生物合成硫代葡萄糖苷。根据这一条思路,本课题主要完成了以下工作：通过KEGG和相关文献研究植物体中硫代葡萄糖苷生物合成途径,根据NCBI和BRENDA等数据库获取大量同工酶,重新设计在大肠杆菌中硫代葡萄糖苷的生物合成途径,并设计了3个表达模块。通过宿主耐受性实验证明可以以大肠杆菌为底盘生物生产硫代葡萄糖苷。将上游模块涉及的5个基因进行克隆表达,最终获得目的蛋白。成功将大肠杆菌来源的4个基因livE、leuC、leuD=leuB构建在载体pET-Duet1上进行过表达。将拟南芥来源的MAM1分别构建在载体pET-Duet1和pET-28a上进行异源表达,通过SDS-PAGE电泳比较蛋白表达效果,结果显示构建在载体pET-Duet1的基因MAM1表达效果更好,含有更少的包涵体,选定pET-Duet1作为MAM1的表达载体。利用质谱和谷氨酸试剂盒检测transaminase B的催化活性,质谱结果显示有产物4-甲硫基-2-氧代丁酸的生成,谷氨酸试剂盒检测结果显示谷氨酸生成量为0.7364 nmol/50μL,证明ilvE编码的蛋白具有酶活。探索MAM1的酶活检测方法,质谱结果显示4-甲硫基-2-氧代丁酸有消耗,且2-(2’-甲硫基)-乙基苹果酸信号增强；由高效液相色谱检测结果可以看出前30min反应体系中4-甲硫基-2-氧代丁酸减少的速率较空白对照提高了1.33倍；改良赖氏法的数据显示4-甲硫基-2-氧代丁酸消耗量为理论最大值的62%,这些结果共同证明MAM1可以催化4-甲硫基-2-氧代丁酸生成2-(2’-甲硫基)-乙基苹果酸。成功构建上游模块重组质粒pZE 12-livE-MAM1-leuC-leuD-leuB,并将该重组质粒导入宿主菌JM109中发酵,通过LC-MS检测到中间代谢产物,证明上游模块合成途径构建成功。通过高效液相色谱检测到主要副产物来源于醋酸途径,利用Red同源重组技术敲除竞争性支路基因ackA。