肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis -inducing ligand,TRAIL)是1995年wiley小组首先发现并克隆成功的,是肿瘤坏死因子超家族中的一员,它可诱导多种转化细胞和恶性肿瘤细胞凋亡,而对正常组织和细胞无明显毒性作用,这种特性使TRAIL可能成为一种低毒而有前途的抗肿瘤药。虽然天然TRAIL有良好的抗肿瘤作用,但实验发现某些版本的rhTRAIL对正常肝细胞等有细胞毒性,使人们对其生物安全性产生了怀疑。近几年,研制抗人DR4和DR5的功能性单克隆抗体(mAb)成为TRAIL肿瘤生物治疗的有效替代品。本实验室以纯化sDR5免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,获得了诱导肿瘤细胞凋亡的抗人DR5的单克隆抗体(命名为mDRA-6)细胞株。本文对其诱导人白血病细胞凋亡活性及作用机制进行研究。目的:观察抗人DR5单克隆抗体mDRA-6对人白血病细胞系的凋亡诱导活性,并初步探讨该抗体诱导白血病细胞凋亡的分子机制。方法:流式细胞仪检测白血病细胞膜DR5表达水平;MTT法检测mDRA-6对白血病细胞的生长抑制作用;通过细胞形态学变化、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术及DNA Ladder检测mDRA-6对白血病细胞的凋亡诱导作用。间接ELISA测定mDRA-6作用白血病细胞后激活NF-κB蛋白表达水平。Western blotting检测mDRA-6作用后白血病细胞凋亡蛋白改变。JC-1单染流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位改变。结果:1.DR5在白血病细胞系表面的表达:在所检测的4种白血病细胞系表面均有DR5的表达,人白血病Jurkat、U937、HL-60及Raji细胞系DR5的表达分别为97.474%、74.71%、58.8%、42.35%。2. mDRA-6单抗对白血病细胞的细胞毒作用:MTT法检测显示, mDRA-6浓度为10μg /ml作用24h,对Jurkat、U937、HL-60及Raji细胞抑制率分别为85.12%、52.83%、36.48%及30.46%。3.mDRA-6单抗对白血病细胞的凋亡作用:倒置显微镜下所见,经mDRA-6作用4h后,4种细胞呈现典型细胞凋亡的形态特征;Annexin V/PI双染检测mDRA-6作用于白血病细胞Jurkat、U937、HL-60、Raji的结果表明,10μg /ml的mDRA-6作用4种白血病细胞2 h经流式细胞仪检测细胞的凋亡率分别为68.93%、41.95%、32.61%、25.83%。线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测mDRA-6作用于人白血病细胞Jurkat和U937的结果表明,作用4h线粒体膜电位改变率分别为52.35%和51.96%。4. Western blotting结果:mDRA-6作用Jurkat、U937及HL-60细胞后,caspase-3、-9及Cytochrome C均有激活片段;而caspase-8仅在Jurkat细胞有激活片段,无激活的caspase-10片段;在U937和HL-60细胞中仅有激活caspase-10表达,而无激活的caspase-8片段。5.应用caspase-9、-3抑制剂均可部分抑制mDRA-6对Jurkat、U937及HL-60细胞凋亡诱导作用,应用caspase-8抑制剂mDRA-6致Jurkat细胞死亡率降低77.32%(P<0.05),应用caspase-10抑制剂Jurkat细胞死亡率降低15.25%(P>0.05);应用caspase-10抑制剂mDRA-6致U937和HL-60细胞死亡率分别降低69.09%(P<0.05)和77.23%(P<0.05),应用caspase-8抑制剂U937和HL-60细胞死亡率降低4.53%(P>0.05)和8.1%(P>0.05);caspase-8/-10抑制剂对U937和HL-60细胞作用与Jurkat细胞结果相反。6. mDRA-6作用U937、JKT、HL-60细胞15min后, NF-κB的OD值升高。结论:1. Jurkat、U937、HL-60及Raji4种白血病细胞表面均有DR5的表达,但不同白血病细胞表面DR5的表达水平存在着很大的差异。2. NF-κB参与了mDRA-6对白血病细胞的凋亡诱导作用。3. mDRA-6能够诱导人白血病细胞系Jurkat、U937、HL-60及Raji的凋亡,主要通过激活死亡受体细胞凋亡信号传导途径发挥作用,且不同细胞启动不同的起始caspase(caspase-8/10)诱导细胞凋亡。