论文部分内容阅读
背景急性肺损伤（acute lung injury,ALI）是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的一种临床表现,是临床中比较常见的危重症。此外,临床中ARDS的病死率一直居高不下,治疗方法包括保护性通气疗法和对症治疗,药物治疗有待进一步研发。中性粒细胞在损伤初期大量浸润肺脏,产生大量细胞因子、颗粒酶等破坏肺泡上皮细胞,并释放趋化因子招募免疫细胞（如单核巨噬细胞、T细胞）浸润,参与ALI的发展进程,浸润的免疫细胞进一步分泌促中性粒细胞招募的趋化因子,形成炎症级联反应,从而造成ARDS。已有研究表明单核细胞和自然杀伤细胞分泌多种趋化因子加剧肺损伤。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的免疫调节作用为ALI的治疗带来希望。近年来,许多临床前研究表明MSCs移植治疗肺损伤可以显著提高生存率,降低炎症水平,提高细菌清除率。MSCs可以通过调节多种免疫反应促进组织损伤修复:促进免疫抑制性M2巨噬细胞以及Treg细胞的形成、抑制自然杀伤细胞的细胞毒性、抑制树突状细胞的成熟和抗原递呈功能、抑制CD8+T细胞的杀伤能力等。目前对于MSCs移植治疗ALI时肺组织B细胞的免疫调节机制的认识还存在不足。导致B细胞研究较少的原因可能在于ALI早期损伤时,中性粒细胞和单核巨噬细胞大量涌入,导致B细胞的相对丰度降低,限制了逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等传统RNA测序技术研究B细胞转录变化。单细胞转录组测序（single cell RNA-sequencing,sc RNA-seq）重点检测单个细胞中基因的表达水平,可以检测少数细胞中基因表达情况,可以弥补传统测序技术的局限。本论文旨在利用sc RNA-Seq揭示MSCs移植治疗ALI时对肺组织B细胞的免疫调节作用及其机制。方法我们采用气管内滴注脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）来诱导C57BL/6小鼠ALI模型。分离2-3周C57BL/6小鼠致密骨来源的MSCs,培养至3-5代后诱导成骨、成脂分化和测定细胞表面标志物,鉴定为MSCs后进行实验。用PBS溶解LPS至20μg/μL的浓度。实验共分三组:（1）对照组:根据小鼠体重气管内滴注1μL/g的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline,PBS）,4小时后气管内滴注含2%C57BL/6小鼠血清20μL PBS;（2）LPS造模组:根据小鼠体重气管内滴注1μL/g含LPS的PBS,4小时后气管内滴注20μL PBS（含2%C57BL/6小鼠血清）,建立ALI模型;（3）MSC治疗组:根据小鼠体重气管内滴注1μL/g含LPS的PBS,4小时后气管内滴注含5×10~5个MSCs的20μL PBS混合液（含2%C57BL/6小鼠血清）。通过各组小鼠生存率、肺组织病理学改变、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中炎症因子和趋化因子水平及中性粒细胞数量,评价C57BL/6小鼠ALI模型是否成功以及MSCs的治疗效果。利用sc RNA-Seq分析三组小鼠在第3天和第7天的肺组织B细胞转录水平的变化。结果分离到的C57BL/6小鼠致密骨来源的MSCs呈纺锤形状、可贴壁生长且能成骨和成脂分化,并高表达MSCs特异性标志物。MSCs移植治疗可以显著改善LPS诱导的ALI,其中包括降低ALI小鼠的死亡率（92.3%vs 61.5%）、减少BALF中趋化因子和细胞因子的水平以及肺组织病理学的严重程度（减轻了肺组织中炎症细胞浸润、促进纤维素吸收,加快肺泡重新开放）。sc RNA-Seq结果显示,肺组织B细胞在对照组高表达Pax5和Cd22,呈现未分化状态,表现为抑制表型;GO和KEGG富集分析结果显示肺组织B细胞在LPS造模组和对照组之间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）富集在细胞趋化和细胞因子分泌等生物学过程和IFN-γ相关促炎通路。LPS造模组中肺组织B细胞显著上调了趋化因子Ccl3和Ccl4基因的表达水平,这些趋化因子与中性粒细胞浸润肺组织相关,而MSCs移植治疗明显降低了肺组织B细胞趋化因子Ccl4基因的表达水平。MSCs移植治疗的第7天时肺组织B细胞的免疫球蛋白相关基因Iglc2、Iglc3和Ighd表达下降。MSCs所调控的DEGs富集分析结果表明MSCs移植治疗后上调与细胞凋亡有关的基因,下调与体液免疫有关的基因。结论本研究表明,肺组织B细胞在ALI时发挥促炎作用,并高表达中性粒细胞趋化因子。MSCs移植治疗可以显著改善ALI,促进损伤修复。同时,MSCs移植治疗通过抑制ALI小鼠肺组织B细胞趋化因子Ccl4和免疫球蛋白相关基因Iglc2、Iglc3和Ighd的表达,降低中性粒细胞的浸润,从而促进肺损伤修复。我们的研究补充了MSCs移植治疗ALI对肺脏免疫细胞调节机制研究的不足,为MSCs治疗的临床应用提供了数据支持。