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研究背景和目的：肺癌是癌性致死的主要原因之一,而非小细胞肺癌占肺癌的85%。美国每年约新诊断228190例肺癌患者,占癌症诊断的14%。其5年生存率仍然维持在17%左右,40年来并没有得到改善。目前急需治疗肺癌的新方法,哪怕是仅仅改善5年生存率的新方法。白花丹素是白花丹等植物的自然提取物,据报道,白花丹素在多种肿瘤细胞中显示了抑制细胞增殖的效应。而这种效应主要与它的氧化、凋亡、细胞周期抑制等作用相关。为进一步研究白花丹素在人非小细胞肺癌中的作用,本研究选用非小细胞肺癌A549及H23细胞系,检测白花丹素对非小细胞肺癌的作用,前期实验证明,白花丹素对非小细胞肺癌细胞有抑制生长的作用,本研究首次提出同时研究白花丹素促细胞凋亡及细胞自噬两条细胞死亡途径及其相关关系,首次提出采用流式细胞仪定量分析白花丹素培育后肿瘤细胞凋亡和细胞自噬的情况,从而进一步探讨两者的关系,以期找到治疗肺非小细胞肺癌的新的治疗方法。方法：1、细胞培养：A549、H23细胞株复苏后加入RPMI1640培养液+10%胎牛血清于培养瓶,置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。2、细胞活性检测：对数生长期细胞,1×104/孔种入96孔板,细胞培养24h后进行实验。加入不同药物浓度白花丹素(0～200μmol/L),每组4个复孔,培养24h。实验终止时每孔加5μl WST-1,培育20分钟,酶标仪(BIO-RAD Model680)450nm波长测定吸α光度值A。细胞抑制率=(1—实验组平均A值／对照组平均A值)×100%。3、细胞凋亡检测：按不同药物浓度梯度(0.5、2.5、5、10μmol/L)培养对数生长期细胞24h,分别收集5×105个细胞,预冷4℃后用缓冲液重悬,洗涤调节至1×105／ml,按AnnexinV:PE试剂盒说明行流式细胞仪(FACS BIVA option, Becton Dickinson)检测。4、细胞周期检测：对数生长期细胞,按上述分组加入不同药物浓度,培育24小时后,收集细胞,缓冲液洗涤,加70%酒精重悬固定,4℃过夜,缓冲液洗涤,以1ml含有lmg/ml RNA酶及50μg/ml PI的缓冲液重悬,室温暗箱培育30分钟后按PI试剂盒说明行流式细胞仪(FACS BIVA option, Becton Dickinson)检测。5、细胞内活性氧化物检测：对数生长周期细胞,1×104/孔种入96孔板,细胞培养24h后进行实验。按上述分组加入不同药物浓度,每组4个复孔,培养24h。每空加入5μmol/L溶于缓冲液的CM-H2DCFDA,培育30分钟,酶标仪(BIO-RAD Model680)485/530nm波长测定吸光度值A。6、聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白检测：细胞分组加入不同药物浓度(0、0.5、1、2.5μmol/L),培育24小时后,以预冷的缓冲液洗涤,后用蛋白裂解液裂解,4℃下3000g离心10分钟,以蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度(Pierce BCA protein assay kit)。30μg蛋白及加样缓冲液以同等体积混合,95℃加热5分钟,加样于聚丙烯酰胺凝胶行凝胶电泳,然后于4℃下,以200毫安电流转移3小时,将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。纤维素膜经洗涤、封闭、一抗孵育、二抗孵育、清洗后按蛋白显色试剂盒(BioRad enhanced chemiluminescence kit)说明行显色,相关蛋白水平用beta肌动蛋白作平衡。7、白花丹素的药物吸收及亚细胞分布的检测：用共焦显微镜检测白花丹素在A549及H23细胞的药物吸收过程及亚细胞分布。细胞种入8孔方格玻片。培养过夜后,加入白花丹素,作用超24小时。用PBS洗涤细胞3次,并用para-formaldehyde固定。用DAPI染色DNA。盖上盖玻片,用指甲油封口。用Leica TCS SP2激光扫描共焦显微镜检测,检测波长405nm (DAPI),488nm(白花丹素)。8、细胞自噬检测：对数生长周期细胞,5×104/孔种入24孔玻璃底板,细胞培养24h后进行实验。设空白对照组、不同药物浓度白花丹素(0.5～10μmol/L)及2.5μmol/L白花丹+促细胞自噬/抗细胞自噬药物组,每组4个复孔,每孔加入对应药物及15μl CellLight Lysosome-RFP试剂,培养24h。用Leica TCS SP2镭射共焦显微镜以555/584nm波长检测。以WST-1实验作平衡。9、细胞凋亡与细胞自噬间的关系与影响：对数生长周期细胞,1.5×105/孔种于6孔板,培育过夜。设空白对照组、不同药物浓度白花丹素(0.5～10μmol/L)及2.5μmol/L白花丹+促细胞自噬/抗细胞自噬药物/抗细胞内活性氧化物生成药物组,加入对应药物后培育24小时,胰蛋白酶收集细胞,100g离心5分钟,去掉上清,重悬后细胞等分为2份,缓冲液洗涤,一份加Annexnin-ATTO647N:PI试剂,黑暗中培育10分钟。用缓冲液洗涤一次,用190μl结合液重悬,加10μl浓度为20μg/ml的PI,用流式细胞仪(FACS BIVA option, Becton Dickinson)作细胞凋亡检测；另一份洗涤后用1-assay buffer(Enzo Life Sciences Inc, Farmingdale, No.ENZ-51031-K200)重悬,离心收集细胞,用250μl的加了5%的牛血清的无酚红的培养液(Invitrogen, Carlsbad, No.1294895)重悬,并加入250μl稀释的Cyto-ID Green试剂(Enzo Life Sciences Inc, Farmingdale, No. ENZ-51031-K200)混合,37℃黑暗中培育30分钟,离心收集细胞,1-assay buffer洗涤,用500μl新鲜的assay buffer重悬,流式细胞仪(FACS BIVA option, Becton Dickinson)作细胞自噬检测。结果：白花丹素对于A549及H23的半抑制浓度分别为10.87μmol/L及7.80μmol/L,可引起-G2/M细胞周期停滞,cyclin B1及Cdc2水平均明显下降,在A549细胞中,白花丹素使p53的水平升高,P21的表达也以药物浓度依赖的方式上升,受白花丹素处理的H23细胞中却无此表现。白花丹素诱导A549及H23细胞的凋亡,白花丹素处理的各组A549及H23细胞均有明显的Bax表达水平的升高,而Bcl-2的表达则明显降低,Bax/Bcl-2比值的上升,且该作用有浓度依赖；在A549细胞中以浓度依赖方式引起PUMA表达的明显上升,但在H23细胞中无此作用；白花丹素在两种细胞中均诱导细胞色素C的释放；断裂的caspase-3(Asp175)及caspase-9(Asp315)在A549及H23细胞中均被白花丹素以浓度依赖方式激活。白花丹素增加细胞内活性氧化物的水平。用细胞内活性氧化物抑制剂：5mmol/L的NAC、100mmol/L的维生素C或1mmol/L的GSH预处理后的A549及H23细胞,其细胞内活性氧化物的水平明显下降。白花丹素诱导A549及H23细胞的细胞自噬,在A549及H23细胞中,白花丹素均以浓度依赖的方式明显减低P13K(p55)的Tyr199位点的磷酸化、增加p38在Thr180/Tyr182位点的磷酸化、减少Akt的Ser473位点的磷酸化、降低mTOR在Ser2448位点的磷酸化。白花丹素以浓度依赖方式明显诱导beclin1在两种细胞的表达、引起LC3-I及LC3-Ⅱ水平的升高。在两种细胞中,用20mmol/L的SB202190或SB203580处理,均能加强由白花丹素诱导的自噬反应。Chloroquine, bafilomycin及wortmannin抑制白花丹素诱导的自噬反应。：20mmol/L的SB202190及SB203580均明显加强白花丹素诱导的p38磷酸化作用,明显加强白花丹素诱导的mTOR的磷酸化的抑制作用,加强诱导LC3-I及LC3-Ⅱ水平的升高的作用。特异性p38MAPK抑制子及自噬诱导子SB202190,及自噬抑制子wortmannin均可增强A549及H23细胞的基础凋亡,但抑制白花丹素诱导的细胞凋亡。白花丹素处理0.5小时后,白花丹素的绿色荧光已可在细胞浆中发现。12小时后,绿色荧光出现在细胞核周围。24小时后,仅剩细胞外的绿色荧光。结论1、白花丹素以浓度依赖方式抑制A549及H23细胞的生长。2、白花丹素诱导A549及H23细胞的细胞周期停滞。可能与白花丹素抑制细胞生长有关。细胞周期停滞可部分归因于Cdc2及cyclinB1的下调。3、白花丹素在A549细胞中可通过上调p53而增加p21的水平,在H23细胞中却无此作用。这可能与H23细胞中p53基因(M246I)的突变而引起该蛋白部分失活有关。4、白花丹素在A549及H23细胞中均诱导caspase-3及caspase-9的激活并最终导致细胞凋亡性死亡。5、白花丹素在A549及H23细胞明显增加细胞内活性氧化物的水平。而在予活性氧化物清除子预处理后,细胞内活性氧化物的水平明显降低。6、白花丹素在A549及H23细胞通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路诱导细胞自噬。7、Chloroquine, bafilomycin及wortmannin抑制白花丹素诱导的细胞自噬。8、SB202190及SB203580通过增强PI3K/Akt/mTOR通路的抑制增加白花丹素诱导的细胞自噬。9、在白花丹素诱导的细胞凋亡与细胞自噬间有交互联系,白花丹素能被细胞完整而迅速地吸收,并分布于细胞质及细胞核。