论文部分内容阅读
背景与目的:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。虽然我国肝癌的诊疗水平较前明显提高,患者的预后也有了明显的改善,但由于肝癌起病隐匿且进展迅速,肝癌患者的总体生存率仍不容乐观,而术后复发、转移是导致肝癌预后较差的关键因素。因此探索肝癌潜在预后指标,对改善肝癌患者预后具有重要临床意义。而泛素化修饰是调节体内蛋白质翻译后修饰的重要途径之一,与多种生物学过程密切相关。E3泛素连接酶作为泛素化修饰的三种关键酶之一,决定泛素化修饰的特异性,它们的活性异常也被证实与多种肿瘤的发生发展密切相关。然而,由于E3泛素连接酶众多,究竟是哪些关键E3泛素连接酶与肝癌发生发展密切相关?目前还了解甚少近几年来,随着生物信息学研究的高速发展,运用高通量数据分析挖掘疾病相关生物标记物,成为一种高效的研究方法。本研究就建立在这一基础之上,旨在通过整合TCGA数据库中肝癌的数据和E3泛素连接酶基因文库,并通过相应技术手段进行筛选验证,期望从E3泛素连接酶基因文库中获得与肝癌发生发展关系密切且对肝癌的预后预测有较大价值的关键分子标记物。方法:通过TCGA数据库网站下载TCGA-LIHC转录组的Manifest和Metadata数据,然后借助GDC-client下载工具,在cmd环境下下载HTSeq-fpkm数据。利用Perl语言脚本提取原始数据的表达矩阵,通过Ensembl网站下载Homo_sapiens.GRCh38.95.chr.gtf.gz文件,比对后得到基于gene symbol的基因表达矩阵。然后将我们已获得的共718个E3泛素连接酶连接酶相关基因(通过KEGG中E3泛素连接酶参与的生物信号途径汇总,此步骤由江苏苏州泓迅生物科技有限公司协助完成。而KEGG是京都大学生物信息学中心的Kanehisa实验室于1995年建立而成,能借助R语言实现信号通路富集分析的生物信息学分析工具)从TCGA数据库中获得的基因表达矩阵里逐个查找其表达量,建立E3泛素连接酶基因文库。将数据导入进Gene Spring11.5软件以筛选差异表达基因(Differential expression genes,D GEs),设置阈值(|log2FC|>2.0和adj.P.val<0.05)。利用STRING10.5数据库构建DGEs的蛋白互作网络图(protein protein interaction network,PPI),同时下载文本文件,然后将文件导入Cytoscape软件计算出PPI网络中每个DGEs的点度中心性,点度中心性值越高则越表明这个DGEs处在PPI网络中的中心位置,筛选值最高的前10个DGEs作为中枢基因;利用DAVID对E3泛素连接酶基因文库进行生物学功能的分析,选取富集度最高的生物学功能(即细胞凋亡过程),将富集在细胞凋亡上的基因作为下一步研究的候选基因。在TCGA数据库下载到436例肝癌样本的临床数据,数据包括病人的详细临床资料。分别验证候选基因与数据库中肝癌样本生存预后及临床TNM分期的关系,筛选出与肝癌预后及临床TN M分期密切相关的基因(P<0.05),进而将这些筛选出的基因与10个中枢基因进一步交叉比对得到关键基因。最后通过免疫组织化学染色检测并验证其在我中心收集的肝癌临床样本中癌和癌旁中的表达情况,并分析其表达与患者临床病理参数和生存时间之间的关系。结果:通过差异基因筛选,共获得23个DGEs,构建23个DGEs的PPI网络,筛选出点度中心性值最高的前10个作为中枢基因。对E3泛素连接酶基因文库进行生物学功能的分析,将富集度最高的生物学功能上的37个基因作为下一步研究的候选基因。在37个候选基因中发现11个与肝癌预后显著相关并具有统计学意义(P<0.05)。发现12个与临床TNM分期显著相关并具有统计学意义(P<0.05)。将与肝癌预后及临床TNM分期相关的候选基因和PPI蛋白网络中的中枢基因进行交叉比对,得到TRAIP关键基因,其在肝癌组织中的表达量显著高于癌旁组织中的表达量,在蛋白互作网络中也处于中心位置,且TRAIP高表达与肝癌患者预后不良及临床TNM分期都具有统计学意义(P<0.05)。为进一步验证,利用我中心收集的临床样本通过免疫组织化学染色检测TRAIP在癌和癌旁组织中的表达情况,发现其主要在胞浆中表达,且癌中的表达显著高于癌旁组织。分析其表达与患者临床病理参数和生存时间之间的关系,发现其表达与肝癌患者临床TNM分期及肿瘤分化程度显著相关并具有统计学意义(P<0.05),且TRAIP阳性表达时患者的生存率显著降低并具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)通过数据挖掘及单中心临床样本检测验证,发现TRAIP在肝癌组织中的表达显著上调,其表达水平与肝癌患者临床TNM分期、生存状态等密切相关。(2)TRAIP的高表达是肝癌患者预后不良的显著危险因素,是肝癌患者的预后预测新靶标。(3)TRAIP可能通过介导细胞凋亡过程影响肝癌的发生发展,但其具体分子机制尚待进一步阐明,有望使其成为肝癌潜在的治疗新靶点。