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甲型流感病毒mRNA的核质转运的机制尤其是不含内含子的mRNA的出核转运途径迄今仍然不是很清楚。而病毒mRNA在宿主细胞内的定位和运动情况的监测分析对于研究病毒mRNA的出核机制具有重要意义。于是,本研究就利用分子信标技术在活细胞内示踪了甲型流感病毒mRNA的定位和运动,并结合其他研究手段研究了甲型流感病毒mRNA在活细胞内的动态行为和转运机制。
运用活细胞内mRNA成像和荧光漂白恢复技术,研究了流感病毒的不含内含子的NA mRNA在细胞核和细胞质内的动态行为特征。结果显示在37度时,大约50%的流感病毒NA mRNA在细胞核和细胞质中可以自由运动,且细胞质中运动较细胞核内稍慢。这可能与细胞质中的NA mRNA绝大多数定位于微管结构且NA mRNA为膜蛋白mRNA要大部分时间定位于内质网上进行翻译有关。另外,NA mRNA在23度的低温或ATP消除条件下与37度相比,自由运动组分和扩散系数都明显减少,说明流感病毒NA mRNA的细胞内运动是温度敏感型和能量依赖型的过程。
活细胞内mRNA成像结合药物抑制实验研究发现了流感病毒mRNA的出核转运需要宿主细胞的RNA聚合酶II的功能,并且不依赖于CRM1转运途径。另外,通过活细胞内成像实验和固定细胞内的蛋白免疫荧光实验发现流感病毒的三类mRNA可以与NS1蛋白和TAP蛋白在细胞核内存在明显的荧光共定位,并且免疫共沉淀实验表明流感病毒的三类mRNA与NS1和TAP蛋白在细胞核内有相互作用。
总之,运用活细胞内mRNA可视化技术研究了活细胞内流感病毒mRNA的动态行为与转运机制。并从结果可以推测流感病毒mRNA核质转运是利用细胞的TAP/p15途径,在宿主RNA聚合酶II和流感病毒NS1蛋白参与下的耗能运输过程。