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第一部分自组装肽水凝胶支架的制备及材料的理化性质分析目的在RADA16的氨基酸序列上添加RGD功能基序,设计并制备一种新型的自组装肽水凝胶支架RADA16-RGD。通过透射电镜、流变仪对两种水凝胶支架RADA16、RADA16-RGD进行表征,分析它们的理化性质。以期望能进一步研发具有良好机械性能和生物活性的骨组织修复材料。方法通过商业合成自组装肽RADA16和RADA16-RGD,采用高效液相色谱法（HPLC）分析材料的纯度。使用透射电镜（TEM）观察RADA16和RADA16-RGD的微观结构,通过流变仪检测两种材料的机械性能。结果HPLC分析表明,RADA16与RADA16-RGD的纯度分别为97.78%和98.58%。TEM结果表明,在磷酸盐缓冲液（PBS）的诱导下,RADA16和RADA16-RGD均可以自组装形成纳米纤维网状结构。流变仪结果表明,RADA16和RADA16-RGD在PBS溶液中比在去离子水中具有更高的储能模量（G’）,高浓度肽组的G’值要高于低浓度组。结论RADA16与RADA16-RGD在PBS溶液中均可以自组装形成纳米纤维网状结构,这种结构可以模拟细胞外基质（ECM）,用于细胞培养。此外,在PBS溶液的诱导下,两种多肽能够自组装形成具有一定机械性能的凝胶,提高肽的浓度可以在一定程度上改善肽的机械强度。第二部分自组装肽水凝胶支架的生物活性目的通过细胞在不同的基质中的培养,来评价RADA16和RADA16-RGD的体外生物活性、生物安全性以及促成骨分化作用。为下一步体内的骨组织修复研究提供实验依据。方法本实验采用小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）,将其分别在RADA16、RADA16-RGD中培养。在细胞培养后的固定的时间点,通过CCK-8检测来评价材料对细胞的增殖作用,通过激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）来观察材料对细胞的粘附情况,采用活死染色的方法来评估两种肽的生物安全性。将MC3T3-E1细胞在不同基质中培养,进行成骨诱导,通过碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红染色和矿化定量检测来评价材料的促成骨分化作用。此外,在成骨诱导培养后的不同的时间点（3、6、9、12、15天）,收集培养基上清,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定Runx2、OPN和Col-I的浓度,来进一步评价自组装肽的体外促成骨能力。结果CCK-8检测结果表明,RADA16组与RADA16-RGD组的吸光度（OD）值均高于对照组,RADA16-RGD组的OD值最高。CLSM结果表明,与对照组相比,两种自组装肽组中细胞的数量、铺展面积和伪足均明显增加,RADA16-RGD组增加最为明显。在活死染色图像中,RADA16与RADA16-RGD均未呈现出明显的生物毒性。为了评价自组装肽对细胞的促成骨分化能力,我们在成骨诱导培养7天后进行了ALP染色,在14天后进行了茜素红染色和矿化定量检测。ALP染色结果表明,两种多肽组的的ALP表达多于对照组,并且RADA16-RGD组的ALP表达更为显著;茜素红染色和矿化定量检测结果呈现出的趋势与ALP染色结果一致。此外,我们通过ELISA检测了MC3T3-E1细胞在不同基质中Runx2、OPN、Col-I的表达情况。结果表明,在检测的15天内,Runx2在RADA16-RGD中的表达最为显著,同时Runx2在各组中的表达均随时间的推移逐渐升高,OPN和Col-I的表达呈现出了与Runx2相同的趋势。结论两种自组装肽RADA16和RADA16-RGD有着良好的促细胞增殖作用和促成骨分化能力,而RADA16-RGD在这两方面表现得更为显著。同时RADA16和RADA16-RGD无明显的生物毒性,进一步证实了它们具有良好的生物相容性。这些结果都说明RADA16-RGD是一种良好的生物活性材料。第三部分自组装肽水凝胶支架对VEGF、BMP-2的体外控制释放作用目的评估RADA16、RADA16-RGD在载有单因子（VEGF或BMP-2）时和载有双因子（VEGF和BMP-2）时对VEGF、BMP-2的控制释放作用。此外,通过细胞在不同的基质中的培养,来评价载有不同生长因子的RADA16-RGD的生物活性、生物安全性和促成骨分化作用。方法将VEGF、BMP-2的蛋白溶液加入到RADA16、RADA16-RGD的肽溶液中,充分混合,加入PBS溶液促进肽自组装,分别于1小时、3小时、6小时、12小时、1天、3天、7天、14天、21天、28天,收集上清液作为检测样本,同时缓慢的补充相同体积的PBS溶液。通过ELISA测定2种蛋白的浓度,然后采用菲克第二定律计算得出每个时间点的累积释放率,绘制释放曲线。将MC3T3-E1细胞在载有单因子（VEGF或BMP-2）、载有双因子（VEGF和BMP-2）的RADA16-RGD中培养,通过CCK-8检测和活死染色来评价载生长因子多肽的生物活性和生物安全性。将MC3T3-E1细胞在不同基质中培养,进行成骨诱导,通过ALP染色来初步评价生长因子多肽的促成骨分化能力。结果两种自组装肽中的VEGF和BMP-2在的最初1小时和12小时内均表现出了快速的释放,释放曲线呈先快后缓的趋势。在单因子的载体中,与BMP-2相比,VEGF在同种材料中的释放较慢,而RADA16-RGD对VEGF或者BMP-2的释放要快于RADA16;在双因子的载体中,VEGF和BMP-2的释放呈现出了与单因子载体相同的趋势。CCK-8检测结果表明,载双因子的RADA16-RGD组的OD值要高于载单因子的RADA16-RGD组。在活死染色中,我们发现,无论是载双因子还是载单因子的RADA16-RGD均未表现出明显的生物毒性。在成骨分化实验中,ALP染色结果表明,载双因子的RADA16-RGD组的表达最为显著。结论RADA16和RADA16-RGD对生长因子的释放速率在12小时后逐渐趋于平稳,在检测的28天内实现了对生长因子缓慢持续的释放,说明RADA16和RADA16-RGD是良好的蛋白控释材料。更重要的是,在双因子载体中,VEGF和BMP-2的释放呈现出了与单因子载体相同的趋势,这为载生长因子多肽的研究提供了一项新的策略。此外,通过细胞在载有不同生长因子的RADA16-RGD的培养,证明了载双因子的RADA16-RGD具有更好的促细胞增殖作用和促成骨分化能力。这为自组装肽的在促进成骨和控释多种蛋白方面的应用提供了一个有前景的策略。