【摘 要】
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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡为主要病理特征的神经退行性疾病。随着发病率的逐年攀升,单纯补充多巴胺只能在短期内改善症状的局限性使得治疗策略开始转向保护“原发性”多巴胺能神经元的进行性丢失。氧化应激、神经炎症都是导致多巴胺能神经元死亡的重要驱动因素,而曲尼司特是应用于临床的抗过敏药物,具有抗炎、抗纤维化、抗氧化等多重作用,但其尚未
【基金项目】
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广东省自然科学基金（No.2017A030313884）；
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目的:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以中脑黑质多巴胺能神经元变性死亡为主要病理特征的神经退行性疾病。随着发病率的逐年攀升,单纯补充多巴胺只能在短期内改善症状的局限性使得治疗策略开始转向保护“原发性”多巴胺能神经元的进行性丢失。氧化应激、神经炎症都是导致多巴胺能神经元死亡的重要驱动因素,而曲尼司特是应用于临床的抗过敏药物,具有抗炎、抗纤维化、抗氧化等多重作用,但其尚未在PD中有过研究。基于曲尼司特药理作用与导致多巴胺能神经元损伤机制的密切关系,本实验旨在探究曲尼司特是否能保护多巴胺能神经元及其可能的作用机制。方法:（1）考察曲尼司特是否能够减轻MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的损伤及其可能机制:通过MTT、乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase,LDH）试剂盒检测细胞活力及毒性水平变化;Hoechst染色、流式细胞术以及Western blot检测细胞形态、凋亡细胞数目变化及凋亡相关蛋白水平变化;选用四甲基罗丹明乙酯（Tetramethylrhodamine Ethyl Ester,TMRE）和 DCFH-DA 染料检测线粒体膜电位及细胞内超氧阴离子水平变化;通过丙二醛（Malonicdialdehyde,MDA）以及Western blot来分别测定细胞内MDA以及硫氧还原酶蛋白酶1（Thioredoxin reductase1,TrxR1）、细胞外调节蛋白激酶（Extracellular-signal-regulated kinases,ERK1/2）蛋白水平变化。同时探究ERK1/2蛋白的抑制剂SCH772984是否能够阻断曲尼司特的保护作用。（2）考察曲尼司特是否能够减轻脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的BV2细胞的炎症:利用曲尼司特干预LPS处理的BV2细胞,通过CCK-8检测细胞活力;Elisa检测细胞上清IL-1β水平;利用Western blot检测NLRP3炎症小体相关通路蛋白及相关炎症蛋白水平变化。（3）验证曲尼司特对MPTP诱导的PD小鼠的保护作用及机制:利用曲尼司特治疗MPTP诱导的PD小鼠,通过行为学实验（爬杆、转棒、平衡木实验）来评估小鼠运动功能力的变化;通过免疫荧光和Western blot检测黑质-纹状体区域多巴胺能神经元的损伤情况、小胶质细胞的激活情况以及相关蛋白水平变化。结果:（1）在MPP+诱导的SH-SY5Y体外细胞损伤模型中,曲尼司特能够显著增强细胞活力、降低细胞毒性水平、改善细胞形态、降低细胞凋亡率及逆转凋亡相关蛋白水平变化;还能提高线粒体膜电位水平、降低细胞内活性氧水平、增加细胞内源性抗氧化酶水平。但给予ERK1/2抑制剂SCH772984后削弱了曲尼司特的保护作用,导致SH-SY5Y细胞的活性下降,LDH释放增加,同时还伴随着细胞内ROS水平的上升以及TrxR1蛋白表达水平的下降。（2）在LPS处理的BV2细胞的体外炎症模型中,曲尼司特能够减少LPS与Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）的结合,减少核转录因子κB（Nuclear factorkappa-B）的核转位,降低核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD like receptor protein 3,NLRP3）、一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表达水平,减少细胞上清IL-lβ的释放水平。（3）在MPTP诱导的体内PD小鼠模型中,曲尼司特能够缩短小鼠爬杆时间、增加小鼠在滚轴上的时间、减少小鼠穿越平衡木时的后足滑落次数。同时还能够增加小鼠黑质纹状体区域内的酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase,TH）及ERK蛋白的表达水平,降低NLRP3炎症小体复合物及相关蛋白表达水平。结论:曲尼司特能够在MPP+/MPTP诱导的体内外PD实验模型中发挥神经保护作用。其机制可能是通过增强ERK1/2信号通路来减轻氧化损伤以及减轻NLRP3激活的相关神经炎症有关。
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