不同繁殖模式石龙子输卵管组织的转录组测序及CaBP-D28k基因的扩增与表达

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印度蜓蜥(Sphenomorphus indicus)和股鳞蜓蜥(S.incognitus)是蜓蜥属(Sphenomorphus)两种不同繁殖模式的蜥蜴,其中印度蜓蜥为卵胎生物种,而股鳞蜓蜥为卵生物种。繁殖方式从卵生到卵胎生的过渡是生物进化史上的一次重大演变,根据国内外同行在该领域的研究发现石龙子科动物是研究卵胎生进化的最佳材料。目前有关卵胎生进化的研究多集中在形态学、生理学、系统发育学、生态学等方面,而缺少基于转录组学深入挖掘繁殖模式进化转变的分子机制。蜥蜴的繁殖过程中离不开钙等营养物质的供应,其中维生素D依赖性钙结合蛋白(CaBP-D28k)在钙的调节和转运中起到了重要作用,但在不同繁殖模式蜥蜴的生殖组织中的定位研究相对较少。本实验中分别对印度蜓蜥和股鳞蜓蜥在未怀卵、怀卵和产后状态下的输卵管组织进行转录组测序及CaBP-D28k基因的扩增与表达实验,探究不同繁殖模式蜥蜴在分子水平上的异同点,现得到如下结果:1、通过对印度蜓蜥输卵管组织进行转录组测序分析,共获得了70.04Gb Clean Data,通过拼接得到了57148条Unigenes,其中仅有16471条Unigenes(28.82%)至少在一个数据库中得到注释,同样在股鳞蜓蜥的转录组数据中,获得的70.01Gb Clean Data,通过拼接得到56205条Unigenes,也仅有15279条Unigenes(27.18%)至少在一个数据库中得到注释,注释结果比例较低,仅有一小部分基因得到了注释,较多基因未在数据库中得到注释,这些未知基因为之后更好地挖掘蜥蜴类中的新基因、探究新功能提供有利线索。2、对印度蜓蜥和股鳞蜓蜥注释到的基因进行功能分类,二者分别注释到GO数据库中,共有8649条和8404条Unigenes分别归属到58个和59个GO功能分类中,且在细胞组分、分子功能和生物过程三大类别中所占比例最高的功能分类均相等,所占比例也相类似。在KOG功能分类中,印度蜓蜥和股鳞蜓蜥分别有11185条和10456条Unigenes被注释到25个类别中,且在两个物种中注释最多的类别都是一般功能预测类别,其次是信号转导机制功能,所占比例几乎相等。印度蜓蜥和股鳞蜓蜥分别有10530和9809条Unigenes分别归属于297和290个相应的KEGG代谢通路中,且在两种蜥蜴排名前10位的KEGG途径中,相同的途径有8个,最大的pathway类别均是Endocytosis途径。通过对上述结果的分析发现,在蜓蜥属中两种不同繁殖模式蜥蜴的功能及代谢途径基本类似,具有相似的转录组学特征。3、我们还对印度蜓蜥和股鳞蜓蜥两种不同繁殖模式蜥蜴输卵管组织在未怀卵、怀卵和产后三种状态下的差异表达基因进行了分析,其中在印度蜓蜥(卵胎生)的输卵管中,未怀卵与怀卵状态之间筛选到了677个差异表达基因,其中被注释的基因有449个;怀卵与产后状态之间共筛选到了3275个差异表达基因,被注释的基因有1928个;产后与未怀卵状态之间共筛选到了3207个差异表达基因,其中被注释的基因有2011个。而在股鳞蜓蜥(卵生)的输卵管中,未怀卵与怀卵之间仅有39个差异表达基因,被注释的基因仅有12个;怀卵与产后之间筛选到了165个差异表达基因,被注释的基因有104个;产后与未怀卵之间有406个差异表达基因,被注释的有276个,各组之间差异表达基因数量较之印度蜓蜥中明显减少,推测这可能与蜥蜴的繁殖模式不同有关联。4、利用RACE技术首次对印度蜓蜥和股鳞蜓蜥的CaBP-D28k基因进行全长扩增,印度蜓蜥CaBP-D28k基因的全长序列为1132bp,股鳞蜓蜥CaBP-D28k基因的全长序列为2499bp,其中开放阅读框(ORF)均为789bp,编码262个氨基酸,对CaBP-D28k的氨基酸序列进行分析,发现CaBP-D28k蛋白是一种含有6个EF-hand结构域的亲水性稳定蛋白,不存在跨膜结构和信号肽。基于扩增出来的两种蜓蜥的CaBP-D28k基因c DNA序列和翻译的氨基酸序列与其他物种的同源序列,构建了N-J树,系统进化结果表示印度蜓蜥和股鳞蜓蜥聚为一类,并与安乐蜥、鬃狮蜥、多疣壁虎等物种共同归属在有鳞目这一分支。组织表达图谱分析表明,CaBP-D28k基因的m RNA在印度蜓蜥和股鳞蜓蜥未怀卵的输卵管组织中低表达,在怀卵状态下显著上调,在产后状态下显著降低,即CaBP-D28k基因的m RNA在两种不同繁殖模式蜥蜴的三种状态下的表达趋势是一致的,在怀卵阶段上调的表达量略有差异,表明CaBP-D28k基因参与钙的调节和转运与蜥蜴的繁殖模式无关,这与在卵生和卵胎生蛇类中的研究结果一致。
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