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背景：慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是造血干细胞的恶性增殖性疾病。大约95%的CML患者的原代细胞中出现Ph染色体,核型为t(9；22)(q34；q11),其编码的Bcr-Abl融合蛋白具有异常增高酪氨酸激酶活性,是导致CML发生的主要机制。伊马替尼(imatinib)是Bcr-Abl的靶向抑制剂,可使CML慢性期患者8年生存率(?)85%。目前是CML慢性期患者的一线用药。然而有资料表明,近35%的患者在治疗过程中产生了耐药性,严重影响了CML的治疗效果。Bcr-Abl点突变是伊马替尼耐药的主要机制,其突变发生在很多位点,而T315I位点最为常见。更为重要的是,第二代酪氨酸激酶抑制剂如尼罗替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasatinib)对Bcr-Abl-T3151突变无效。迄今为止,各种酪氨酸激酶抑制剂均不能完全清除CML患者体内Bcr-Abl阳性的白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)；即使患者经过伊马替尼治疗达到完全分子学缓解,仍可以检测到LSC,这是导致CML复发的主要机制之一。最新的研究显示,CML LSC存活不依赖于Bcr-Abl的活性。因此,治疗CML迫切需要寻找更佳的药物,来克服T315I位点突变产生的耐药,并且彻底清除休眠期的LSC。从天然中药中筛选出抗肿瘤药物,不失为一条切实可行的思路。中药苦参具有多种活性成分,包括苦参碱(matrine)、氧化苦参碱(oxymatrine)、槐果碱(sophocarpine)、槐定碱(sophoridine)等。其中对苦参碱的研究最为广泛。苦参碱具有抗肿瘤、抗炎、抗肝纤维化、抗心律失常等多方面的作用,而抗肿瘤作用近年来受到了越来越多的关注。许多研究结果显示,苦参碱具有广谱抗肿瘤作用,且在对肿瘤细胞杀伤抑制的同时,对正常造血细胞几乎没有影响。这表明,苦参碱对肿瘤细胞有一定的特异性。但是,关于苦参碱对p210-T315I突变的细胞株以及CML LSC的研究还未见报道。为此,本研究分为两部分进行阐述：1.苦参碱对慢性粒细胞白血病细胞生长抑制和诱导凋亡的影响研究；2.苦参碱抗慢性粒细胞白血病作用的分子机制研究。第一部分：苦参碱对慢性粒细胞白血病细胞生长抑制和诱导凋亡的影响研究目的：探索苦参碱在体内外对CML细胞的生长抑制和诱导凋亡的作用。方法：采用MTT法检测苦参主要活性成分对CML细胞株K562细胞的生长抑制作用；MTT法检测不同浓度的苦参碱作用CML细胞株细胞和人正常肝细胞株L02细胞的生长抑制作用；集落培养法和流式细胞术检测苦参碱作用CML细胞株细胞的集落形成能力、细胞周期和细胞凋亡情况。采用MTT法、Annexin V/PI双染法检测苦参碱作用CML慢性期、急变期、T315I突变患者原代细胞和正常对照组的细胞生长、凋亡作用。免疫磁珠方法分选出CML患者和正常对照的CD34+细胞,MTT法检测苦参碱作用CML患者CD34+细胞的生长抑制作用,集落培养实验和Annexin V/PI双染法比较苦参碱作用后两组的集落形成能力和细胞凋亡。构建32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠模型,检测苦参碱对小鼠瘤体生长的影响。结果：(1)苦参碱对K562细胞株细胞的抑制作用更为敏感,苦参碱的24小时IC50为1.37mmM,槐果碱、槐定碱和氧化苦参碱均大于3.2mM；(2)苦参碱对K562、K562/G、32Dp210、32Dp210-T315I细胞株细胞具有生长抑制作用,明显高于L02,p值分别为0.017、0.031、0.048、0.013；(3)苦参碱抑制K562、32Dp210-T315I细胞株细胞的集落形成能力；(4)苦参碱不影响K562细胞株细胞的细胞周期；(5)苦参碱对K562、K562/G、32Dp210、32Dp210-T315I细胞株细胞均具有诱导凋亡作用；(6)苦参碱对CML慢性期、急变期、T315I突变患者原代细胞均具有生长抑制作用,且明显高于正常对照组,p值分别为0.017、0.044、0.030；(7)苦参碱对CML慢性期、T315I突变患者原代细胞均具有诱导凋亡作用,浓度为1.6mM时明显高于正常对照组,p值分别为0.006、0.007；(8)苦参碱对CML患者CD34+细胞具有生长抑制作用,24小时IC50为3.38mmM；(9)苦参碱对CML患者CD34+细胞具有抑制克隆形成能力,明显高于正常对照组,p值分别为0.002；(10)苦参碱对CML慢性期、T315I突变患者CD34+细胞均具有诱导凋亡作用,明显高于正常对照组,p值分别为0.004、0.013；(11)苦参碱组(50mg/kg)苦参碱组(100mg/kg)均可以显著抑制32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体增长,与对照组有统计学差异,分别0.000、0.000。结论：(1)苦参碱对CML细胞株细胞具有显著的抑制增殖和集落形成能力,并诱导细胞凋亡,而对L02细胞作用不明显；(2)苦参碱对CML患者原代细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用,明显高于正常对照；(3)苦参碱对CML患者CD34+细胞具有抑制增殖和集落形成能力,并诱导细胞凋亡,而对正常对照作用不明显。(4)苦参碱可以显著抑制32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体增长；(5)苦参碱具有低毒高效,可以克服Bcr-Abl-T315I突变、CML LSC引起的耐药。第二部分：苦参碱抗慢性粒细胞白血病作用的分子机制研究目的：探索苦参碱对CML细胞株细胞、CML CD34+细胞的信号转导通路的影响。方法：采用Western blot检测苦参碱作用K562,32Dp210-T315I细胞株细胞后Bcr-Abl及其下游通路PI3K/Akt、JAK/STAT、Ras/RAF/MEK/ERK关键蛋白的表达变化；Western blot检测苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞的β-catenin/c-Myc通路关键蛋白及其Caspase家族蛋白的表达变化；实时定量PCR方法检测苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞的c-Myc的表达变化；免疫组织化学的方法检测32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体组织c-Myc; c-Myc抑制剂10058-F4联合苦参碱作用K562,32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后,用MTT法、Annexin V/PI双染法检测细胞生长、凋亡；用siRNA (small interfering RNA)沉默THP-1细胞株细胞的c-Myc基因,通过MTT法、Annexin V/PI双染法检测c-Myc基因沉默后对苦参碱作用THP-1的影响；Caspase抑制剂z-VAD-fmk作用于K562、3(?)p210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞,用MTT法检测z-VAD-fmk对苦参碱作用的影响。结果：(1)苦参碱并不能明显引起p-Bcr-Abl、Bcr-Abl以及下游的PI3K、p-Akt、 P-STAT5、p-ERK等信号分子的变化；(2)苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后,(3-catenin、c-Myc蛋白水平均出现明显下调,并伴随Caspase-9、Caspase-3和]PARP不同程度的激活；(3)苦参碱作用K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后,c-Myc mRNA水平出现明显下调；(4)与对照组相比,苦参碱组32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体组织c-Myc蛋白表达显著降低；(5)10058-F4预处理K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后给予苦参碱,可增强苦参碱的细胞抑制作用,p值分别为0.007、0.001、0.003；同时可增强苦参碱诱导K562细胞株细胞和CML患者CD34+细胞凋亡的能力,p值分别为0.002、0.008；(6)沉默THP-1的c-Myc基因后给予苦参碱,可增强苦参碱的生长抑制作用,p值为0.001；同时增强苦参碱诱导凋亡能力,当苦参碱浓度为0.8、1.6mM时p值分别为0.013、0.004；(7)z-VAD-fink处理K562、32Dp210-T315I细胞株细胞和CML患者CD34+细胞后给予苦参碱,可部分逆转苦参碱的抑制作用,p值分别为0.003、0.021、0.002。结论：(1)苦参碱不依赖Bcr-Abl,而是通过下调β-catenin/c-Myc通路,从而诱导K562,32Dp210-T315I细胞株细胞以及CML CD34+细胞的凋亡；(2)苦参碱可以降低32Dp210-T315I细胞荷瘤小鼠瘤体组织c-Myc蛋白表达；(3)c-Myc抑制剂可以增强苦参碱对K562、32Dp210-T315I细胞株细胞以及CML CD34+细胞的生长抑制和诱导凋亡作用；(4)沉默c-Myc可以增强苦参碱对THP-1细胞株细胞的生长抑制和诱导凋亡作用；(5)苦参碱诱导的凋亡在一定程度上依赖Caspase家族蛋白的活化。