论文部分内容阅读
口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的偶蹄动物的烈性传染病,对全世界和我国的畜牧业危害极大。天然免疫应答是机体抵抗病原入侵的第一道防线,在抵抗病原传播和疾病的发展过程中发挥重要的作用,其中视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ介导的信号通路能够在FMDV入侵宿主细胞后被激活,诱导Ⅰ型干扰素和炎性因子的合成与分泌来抑制FMDV的增殖。FMDV 3B蛋白（VPg）的结构相对稳定,活性较低,当3B蛋白的结构和活性正常时,宿主细胞内才可产生感染性强的病毒。早期对宿主抗FMDV感染的研究发现,FMDV侵入机体后能调控宿主天然免疫,从而诱导Ⅰ型干扰素释放,FMDV的多个结构蛋白及非结构蛋白,以及基因组RNA均参与了这一调控过程。目前关于FMDV 3B蛋白的研究较少,它在FMDV复制过程中的功能,以及其与宿主蛋白的相互作用尚不清楚。本研究以FMDV 3B蛋白为诱饵蛋白,利用免疫共沉淀-质谱联用技术在宿主细胞中筛选与FMDV 3B蛋白相互作用的宿主蛋白,从中选取天然免疫系统中的重要相关蛋白,并利用病毒感染、基因过表达和siRNA干扰试验等方法研究FMDV非结构蛋白3B影响宿主先天性免疫的机理,获得了以下结果。1.在PK-15细胞中筛选到了与FMDV 3B蛋白相互作用的宿主蛋白。以FMDV China/1/99株基因组为模板,扩增了3B的核苷酸序列,构建了重组载体Flag-3B、Flag-GFP并将其转染到PK-15细胞中表达,通过Western blot检测蛋白表达量和荧光显微镜观察GFP的表达,确定目的蛋白的最佳表达时间为转染后36 h,所以选取36 h时收获细胞用于免疫共沉淀试验。然后以FMDV的3B蛋白为诱饵蛋白,进行针对Flag抗体的免疫共沉淀试验,沉淀与3B蛋白相互作用的宿主蛋白,沉淀产物进行质谱分析,最后从质谱结果中选取了天然免疫系统中的中枢接头蛋白——病毒诱导信号接头蛋白（VISA）作为下一步的研究对象。2.FMDV 3B蛋白与VISA蛋白在细胞内和细胞外均存在相互作用。前面用免疫共沉淀-质谱联用技术筛选到了与FMDV 3B蛋白相互作用的宿主细胞蛋白VISA。为了避免试验结果假阳性的存在,进一步利用免疫共沉淀和GST pull-down验证3B蛋白和VISA蛋白在体内和体外的相互作用。首先从PK-15细胞中扩增到了VISA的核苷酸序列并构建了真核表达载体VISA-Myc,将质粒VISA-Myc转染至293T细胞中表达,用Western blot检测到VISA蛋白在293T细胞中表达成功。将VISA-Myc与Flag-3B共转PK-15细胞中,用Anti-Flag琼脂糖珠进行免疫共沉淀试验,然后用兔抗Myc多克隆抗体在沉淀物中检测到了VISA-Myc蛋白的存在,证明3B蛋白能够与VISA蛋白在细胞内相互作用。然后在大肠埃希菌中原核表达融合蛋白GST-3B,Western blot证明其最佳表达时间为诱导后6 h,同时在293T细胞内转染表达融合蛋白VISA-Myc,提取融合蛋白进行GST pull-down试验,用兔抗Myc多克隆抗体在沉淀物中检测到了VISA-Myc蛋白的存在,证明3B蛋白与VISA蛋白在细胞外也存在相互作用。为了鉴定3B蛋白与VISA蛋白的互作区域,构建了一系列3B截断体质粒Flag-3B1、Flag-3B2和Flag-3B3,用免疫共沉淀试验鉴定出与VISA蛋白相互作用的是3B3蛋白。3.VISA蛋白对FMDV增殖的影响。FMDV感染PK-15细胞后,分别检测感染后0h、2h、4h、6h、8h、12h和24h VISA基因转录和蛋白表达的情况,荧光定量PCR检测发现FMDV的mRNA量和VISA的mRNA量都随着FMDV感染时间的延长而升高,提示在PK-15细胞中FMDV的感染能够上调VISA基因的转录;Western blot检测内源性VISA蛋白量随着FMDV感染时间的延长而逐渐降低。在PK-15细胞中转染不同浓度的VISA-Myc质粒,并于转染后24 h接种1MOI FMDV,荧光定量PCR证明随着VISA-Myc质粒转染量的增加,VISA mRNA量明显增加,同时FMDV的mRNA量则明显降低,TCID50试验表明细胞培养上清中FMDV的病毒滴度也明显降低,说明在PK-15细胞中过表达VISA会明显抑制FMDV的增殖。用siRNA干扰PK-15细胞中VISA基因的转录,然后接种0.5 MOI的FMDV,分别于接毒0 h、4 h、8 h和12 h后检测FMDV的mRNA转录情况,荧光定量PCR表明与对照组siVISA-nc相比,siVISA-1转染组PK-15细胞中FMDV基因组RNA显著增加,说明干扰VISA能够促进FMDV的复制。4.FMDV 3B及VISA对Ⅰ型干扰素通路的影响。将VISA-Myc质粒转染PK-15细胞,荧光定量PCR显示在PK-15细胞中过表达VISA能上调VISA介导的抗病毒因子TRAF2、TRAF3、TRAF6、TBK1、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、ISG15和OAS1的mRNA水平,说明VISA能诱导宿主抗病毒因子的产生。用IFN-β和IL-6 ELISA试剂盒检测PK-15细胞上清中IFN-β和IL-6的表达情况,结果显示在PK-15细胞中过表达VISA能够提高IFN-β和IL-6的分泌,FMDV感染能够减少VISA介导的IFN-β和IL-6的mRNA表达。说明FMDV感染能抑制VISA介导的天然免疫因子的产生。FMDV 3B蛋白能够下调VISA诱导的IFN-β的分泌,同时也能够下调VISA诱导的IL-6的分泌。这些结果说明,3B能抑制VISA介导的天然免疫因子的产生。综上所述,本研究证明FMDV 3B蛋白和宿主细胞VISA蛋白在细胞内和细胞外均存在相互作用,FMDV感染的PK-15细胞中内源性VISA的转录水平升高,而VISA蛋白量随着FMDV感染时间的延长逐渐降低。在PK-15细胞中过表达VISA会抑制FMDV的复制,而在PK-15细胞干扰VISA表达则促进FMDV的复制,表明VISA在机体抗FMDV感染过程中发挥着重要的作用。进一步的研究发现过表达VISA能上调VISA介导的天然免疫因子mRNA水平,同时过表达VISA能增强IFN-β和IL-6的分泌。FMDV感染能抑制IFN-β和IL-6的分泌,过表达3B蛋白也能抑制IFN-β和IL-6的分泌。说明FMDV 3B通过其3B3蛋白与VISA蛋白相互作用以抑制VISA信号通路,减少IFN-β和IL-6的表达,从而逃避宿主的天然免疫系统,促进FMDV的复制。