【摘 要】
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鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.typhimurium）是一种常见的食源性致病菌,为肠杆菌科革兰氏阴性菌。鼠伤寒沙门氏菌通过污染食物进行传播,可导致急性肠胃炎、伤寒、败血症等多种疾病。由鼠伤寒沙门氏菌感染引发的疾病在全球范围内已经成为主要的公共卫生威胁。本研究利用核酸适配体对鼠伤寒沙门氏菌的特异性识别作用,结合金纳米粒子交联与解交联特性构建可视化检测方法,以克服传
【基金项目】
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吉林省省级产业创新专项资金项目（编号:2018C054-2）；
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鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S.typhimurium）是一种常见的食源性致病菌,为肠杆菌科革兰氏阴性菌。鼠伤寒沙门氏菌通过污染食物进行传播,可导致急性肠胃炎、伤寒、败血症等多种疾病。由鼠伤寒沙门氏菌感染引发的疾病在全球范围内已经成为主要的公共卫生威胁。本研究利用核酸适配体对鼠伤寒沙门氏菌的特异性识别作用,结合金纳米粒子交联与解交联特性构建可视化检测方法,以克服传统检测方法中灵敏度低、操作繁琐、检测时间长等不足。研究内容有以下方面:（1）基于核酸适配体探针比色法检测鼠伤寒沙门氏菌。采用柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子,利用核酸适配体与金纳米粒子静电吸附构建核酸适配体探针。当鼠伤寒沙门氏菌存在时,核酸适配体脱离金纳米粒子特异性结合鼠伤寒沙门氏菌,金纳米粒子在盐作用下发生聚集,导致溶液颜色和吸光度发生变化。对实验参数进行优化,即氯化钠最佳浓度为0.2 mol/L;核酸适配体最佳浓度为0.15 mmol/L。在最佳条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度与金纳米粒子在650 nm和525 nm波长吸光度比值(A650/525)呈现良好的线性关系,绘制标准曲线Y=0.0233lg X+1.0149,R~2=0.9916,线性关系范围为2.9×10~3～2.9×10~7 CFU/m L,检测限为2.9×10~2 CFU/m L,检测时间为15 min。对人工污染的牛奶样品做加标回收实验,回收率为90.5%～110.0%。实验结果表明,该方法特异性强,简单便捷。（2）基于核酸适配体结构开关检测鼠伤寒沙门氏菌。为进一步解决盐对体系的影响,提高检测体系的稳定性,设计了由核酸适配体、互补链、巯基修饰单链构成的三条链结构开关。当鼠伤寒沙门氏菌不存在时,核酸适配体与互补链碱基互补配对,形成结构开关,金纳米粒子聚集体系为蓝色。当鼠伤寒沙门氏菌存在时,鼠伤寒沙门氏菌与核酸适配体的高亲和性促使核酸适配体结构开关打开释放互补链,金纳米粒子分散开体系变为红色。利用反应前后金纳米粒子的交联程度差异性,产生的颜色和紫外吸光度变化,实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。对实验参数进行优化,即DNA1/DNA2最佳浓度为30 nmol/L;核酸适配体与DNA1/DNA2最佳结合时间45 min。经耐盐实验测试,体系耐盐性达到0.8 mol/L。在最佳条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度在1×10~2～1×10~7CFU/m L浓度范围内与吸光度信号呈良好线性关系,绘制标准曲线为Y=0.0387lg X+0.0619,R~2=0.9977,检测限为1×10~2 CFU/m L,检测时间为10 min。应用于人工污染牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌检测,加标回收率为94.2%～101.4%。该方法有效解决盐对检测体系的影响,提高了检测体系的稳定性。（3）基于核酸适配体杂交链式反应比色法检测鼠伤寒沙门氏菌。基于已开展的研究,为提高检测体系的灵敏度,引入杂交链式反应。根据鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体设计引发链和两个发夹探针,核酸适配体捕获鼠伤寒沙门氏菌,触发引发链打开发夹探针,发生杂交链式反应,实现目标菌信号放大同时利用反应前发夹探针粘性末端以及反应后形成的杂交长链对金纳米粒子结合差异性,产生比色信号,实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。经实验验证可行性后,对实验参数进行优化,即杂交链式反应最佳反应时间为45 min;发夹DNA与金纳米粒子最佳结合时间为50 min;Hp1/Hp2最佳浓度为100 nmol/L;金纳米粒子最佳浓度为8 nmol/L;盐最佳浓度为0.4 mol/L。在此条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度与金纳米粒子吸光度比值（A630/525）在1×10~3～1×10~7CFU/m L范围内呈现良好的线性关系,标准曲线方程为Y=0.1864lg X-0.1281,R~2=0.9933,检测限为6.3×10~1 CFU/m L,检测时间为155 min。应用于人工污染的牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌检测时,加标回收率为90.1%～109.1%。经杂交链式反应放大实验信号,提高检出限,实现高灵敏和高特异性检测鼠伤寒沙门氏菌。
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