【摘 要】
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H5N1高致病性禽流感是一种可以在鸟类间传播的烈性传染病,病毒常常由野生禽类携带,通过候鸟的迁徙引起长距离、大范围跨国传播。目前国内已有24个省和自治区发布过有关H5N1禽流感的疫情报告,其造成的直接经济损失十分巨大,消耗的人力物力成本,对上下游产业造成的间接经济损失更是难以估量。除去对养殖业的危害,由于H5N1的跨种间传播特质能对包括人在内的哺乳动物同样造成巨大危害,对人类生命健康造成威胁。本实
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H5N1高致病性禽流感是一种可以在鸟类间传播的烈性传染病,病毒常常由野生禽类携带,通过候鸟的迁徙引起长距离、大范围跨国传播。目前国内已有24个省和自治区发布过有关H5N1禽流感的疫情报告,其造成的直接经济损失十分巨大,消耗的人力物力成本,对上下游产业造成的间接经济损失更是难以估量。除去对养殖业的危害,由于H5N1的跨种间传播特质能对包括人在内的哺乳动物同样造成巨大危害,对人类生命健康造成威胁。本实验通过基因工程的方法制备抗H5N1高致病性禽流感病毒的抗体并加以研究。首先将人类免疫缺陷病毒的TAT蛋白和抗H5N1病毒M1蛋白的全人源单链抗体基因ScFv进行融合表达,使抗体可以穿越细胞膜,获得在细胞内结合病毒的能力,达到阻止病毒在细胞内复制的效果。其次通过在抗体上连接人的mFc片段进行融合表达构建单分子抗体,以增加抗体的稳定性,延长其在体内的半衰期。鉴于M1蛋白是A型流感病毒的基质蛋白,在A型流感病毒各个亚型中具有高度保守的特点,本实验针对M1蛋白的胞内抗体拥有对不同亚型禽流感病毒的广谱中和效果进行研究。为进一步研发广谱抗禽流感病毒药物提供研究基础,具体研究结果如下:（1）成功构建了pET32（a）-His Tag-SUMO-TAT-ScFv M1-mFc表达载体,获得了稳定表达的抗体工程菌。使用SUMO和His Tag的组合,并探索SUMO酶的最适工作条件。通过金属螯合层析和Pro A亲和层析纯化出浓度为0.18 mg/m L的纯品蛋白。（2）利用实验室已有的M1抗原工程菌,使用金属螯合层析和阳离子交换层析纯化出浓度为0.5 mg/m L的纯品M1蛋白作为抗原。并且用Western blot鉴定了其正确性。（3）用Open SPR技术检测TAT-ScFv M1-mFc抗体对M1蛋白具有较强的亲和力,结合的亲和常数为1.31×10-8（M）;抗体活性检测显示,TAT-ScFv M1-mFc单分子抗体可以抑制H1N1病毒的复制,当抗体浓度大于等于1.8×10-4 mg/m L时,对H1N1病毒侵染的MDCK细胞保护率超过95%。使用免疫荧光法验证了TAT-ScFv M1-mFc抗体具有穿模活性;建立小鼠体内半衰期检测方法,测定TAT-ScFv M1-mFc抗体半衰期最高可达40 min。
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