中华蜜蜂工蜂唾液腺形态学观察与转录组分析

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中华蜜蜂作为我国当家蜂种,已适应国内多种地区的气候环境及蜜源植物,又因其优秀的抗病虫害能力,加上良好的低温耐受性和利用零星蜜源能力强等优点,成为国内蜂业发展上的重要一员。在工蜂采蜜产蜜和哺育幼虫等行为中,唾液腺是起到关键作用的一类外分泌腺。本研究在比较出房蜂、哺育蜂和外勤蜂这三个发育阶段的中华蜜蜂工蜂唾液腺结构差异的基础上,采用转录组测序的方法对其在不同发育阶段中的基因表达差异进行了研究,旨在补充中华蜜蜂唾液腺的组织学基础,并厘清唾液腺中基因表达对于其劳动分工以及发育阶段变化产生的响应机制,促进对中华蜜蜂发育过程中形态建成及其分子机制的理解,加深膜翅目昆虫的研究。主要结果如下:1.基于扫描电子显微镜和苏木精-伊红染色石蜡切片观察,工蜂唾液腺在不同发育阶段间存在形态与结构上的差异。其中头唾腺差异集中在腺泡体积与形状、支导管管径和微气管分布上。具体表现为出房蜂阶段皱缩的扁圆形腺泡在哺育蜂和外勤蜂阶段发育为光滑饱满的倒梨形,使得腺泡体积和内部腺泡腔明显扩大,而腺泡壁上的立方细胞也由放射状转变为边缘规则的方形,细胞间的表皮下空间也进一步增大。通过形态测量发现哺育蜂的头唾腺支导管管径相比出房蜂扩大了3.4μm(p<0.05),但与外勤蜂对比不存在显著差异。部分附着在外勤蜂头唾腺组织间的微气管还形成囊状结构的交联。结合前人对头唾腺分泌物的化学分析和功能研究,随发育日龄增加而形成的各项结构差异体现了头唾腺分泌活性和容纳量的逐渐增大,以适应工蜂的劳动分工变化对头唾腺的功能需求。三个发育阶段的工蜂胸唾腺差异集中在分泌小管的内部结构上,出房蜂组表现为分泌小管的分支较少、分泌细胞的细胞质结构松散以及分泌细胞内侧的表皮下间隙狭窄或缺失。在哺育蜂组中出现更多二连分泌小管的分支结构,同时分泌小管管径相比前者有显著增粗(p<0.05),并且分泌细胞的胞质中也出现大量的分泌囊泡,内侧的表皮下间隙呈放射状延伸至周围的分泌细胞表面。外勤蜂组的分泌小管管径仍有小幅加粗(p<0.05),其他内部特征与哺育蜂组基本类似。哺育蜂和外勤蜂的分泌小管表面附着的微气管数量相比出房蜂也明显增加,外勤蜂胸唾腺背侧的两条初级气管与外叶的连接处具有复杂的气管团结构。三组工蜂的胸唾腺多种差异显示出与头唾腺类似的发育规律,为哺育蜂和外勤蜂在完成群体分工上的分泌需要提供组织结构上的基础。2.基于高通量测序平台,对出房蜂(EM)、哺育蜂(NS)和外勤蜂(FG)的唾液腺,每组3个重复,共9组样品进行有参转录组测序。总clean data数据量达66.62GB,各组的GC碱基含量稳定在40%左右,Q30碱基比例达到91.91%-92.85%。以NCBI数据库内中华蜜蜂全基因组(GCA002290385.1)为参考基因组对转录组reads进行匹配,单组匹配率均超过93%,一共确定了 1 1324个基因,其中包括新预测的1388个新转录本。经过筛选共得1353个差异表达基因,其中20个基因为三组组间比较中的共有表达差异基因,出房蜂与外勤蜂两组之间的差异表达基因数目最多,共计1085个,表达上调的基因433个,下调的基因652个。其次是出房蜂和哺育蜂组间,共计752个,上调基因309个,下调基因334个。在前两个对比组中共有的差异表达基因数目达到484个。在哺育蜂和外勤蜂组间仅98个基因存在表达差异,35个表达上调基因,63个表达下调基因,该对比组约25%的差异基因在另两个对比组内未显示出表达差异。转录组差异表达基因的分析结果显示,工蜂的唾液腺通过改变多种基因表达量以适应个体发育日龄增加和劳动分工的改变:(1)工蜂唾液腺内氧化磷酸化代谢通路中大量基因表达量随发育日龄增加出现下调,而包括mTOR信号通路、TGF-β信号通路和Wnt信号通路在内的多条与细胞增殖相关的通路,其中部分基因的表达量随工蜂的日龄增加出现下降,表示工蜂唾液腺在低日龄通过提高能量代谢水平和加快细胞增殖分化速率,促进腺体组织迅速的发育,以满足哺育蜂和外勤蜂阶段的分泌需求。(2)参与淀粉与蔗糖代谢、细胞外基质受体互作和昼夜节律等代谢通路中多种转化酶、膜内在蛋白SV2和周期蛋白Per等基因表达量在哺育蜂和外勤蜂唾液腺内的明显增加,是决定唾液腺作为重要外分泌腺参与到外勤蜂采蜜酿蜜等行为的分子基础,也确保哺育蜂和外勤蜂具备了调节腺体分泌量和分泌活性的能力,以适应不同劳动分工导致的节律性改变。(3)通过对王浆蛋白家族MRJPs各成员和小肽Apisimin的基因表达模式的分析,推测唾液腺可能是王浆蛋白分泌的另一重要场所,且分泌活性与工蜂咽下腺具有相同的变化趋势。
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