蛋白激酶在真核细胞信号转导中起着重要的作用,主要通过磷酸化作用广泛参与动植物的生长、发育、逆境胁迫响应等各项生命活动,其对下游靶蛋白磷酸化的时间和地点受严格调控,导致靶蛋白的磷酸化状态在不同细胞不同时间段存在差异。然而当前对蛋白激酶活性的研究仍存在诸多挑战,特别是在活细胞中对其进行不同时空、实时活性的监测。而基于荧光共振能量转移生物传感器（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）的发现与应用成功实现了对蛋白激酶不同时空的实时监测,也已成为研究各种细胞内生物学过程的有力工具。非生物胁迫（包括干旱和盐害）会触发一个复杂的渗透胁迫和ABA信号传导网络来调节和控制气孔的开关,蔗糖非酵解型蛋白激酶2（Sn RK2）及其家族蛋白Sn RK2.6（又名OST1,OPEN STOMATA 1）作为其中的关键环节,它们的活性调控机制及其时空特异性尚不明确。为此,本研究中开发了基于荧光共振能量转移的第二个植物生物传感器实时报告植物体内Sn RK2激酶活性,将其命名为SNACS（Sn RK2 activity sensor）,应用该生物传感器,对不同信号刺激下（茉莉酸甲酯Me JA和高CO2浓度）拟南芥保卫细胞中Sn RK2激酶活性进行监测,为气孔关闭信号通路的研究提供了重要的依据和有力的技术手段。此外,促丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK/M3K/MEKK）家族中M3Kδ1、M3Kδ6和M3Kδ7对Sn RK2.6/OST1都有很强的激活活性,在Sn RK2蛋白激酶的激活调控中具有重要作用。因此,本研究创制了M3Ks四突变体,并对获得的m3kδ1/δ5/δ6-1/δ7四突变体进行了表型鉴定,为ABA信号通路中依赖于M3Ks的Sn RK2激酶的研究提供重要的遗传材料。本研究取得的主要结果如下:1、利用拟南芥转录因子AKS1（ABA-responsive kinase substrate1）48个氨基酸片段和全长14-3-3（GF14phi）蛋白构建了基于FRET荧光能量转移的生物传感器以监测Sn RK2激酶活性,并将其命名为SNACS。SNACS的工作模型为:Sn RK2激酶磷酸化SNACS中的底物结构域AKS1（ABA-responsive kinase substrate 1）,而14-3-3能够识别并结合磷酸化后的AKS1,从而驱动与其相连的荧光蛋白YPet和Turquoise GL相互靠近,促使荧光蛋白的荧光能量发生转移。2、基于SNACS的工作模型,我们在体外进行了一系列实验,验证其工作模型。首先,通过体外磷酸化和体外荧光能量转移实验表明Sn RK2.6/OST1能磷酸化SNACS,且磷酸化后的SNACS能发生荧光能量转移。其次,在烟草表皮细胞和拟南芥保卫细胞中,利用ABA处理观察到细胞内实时Sn RK2激酶激活,进一步验证了SNACS能实时监测活细胞内Sn RK2激酶活性,作为活性报告者行驶其生物学功能。3、气孔运动直接受保卫细胞调控。在拟南芥保卫细胞中,利用激酶抑制剂对其进行处理,监测激酶抑制剂处理下保卫细胞中Sn RK2激酶活性的变化。结果表明,在10μM K-252a处理下,SNACS荧光比率明显降低,揭示出拟南芥保卫细胞中Sn RK2激酶存在一定的基础活性。更重要的是,Me JA和高CO2浓度作为气孔运动的刺激信号,被证明不会诱导拟南芥保卫细胞中SNACS荧光比率增加,揭示出它们不会激活保卫细胞中Sn RK2激酶活性。4、MAP kinase kinase kinaseδ5在保卫细胞中具有较高的表达量,利用m3kδ5的T-DNA单突变体,与前期成功创制的三突变体进行杂交,构建了m3kδ1/δ5/δ6-1/δ7四突变体。并且,对获得了四突变体进行了表型鉴定,结果表明与m3kδ1/δ6-1/δ7三突变体相比,m3kδ1/δ5/δ6-1/δ7四突变体的ABA不敏性增强。作物对于逆境胁迫下的响应是各种细胞内生物学过程协同表达的结果。而ABA作为重要的逆境激素,其亦可作为作物抗旱的指标之一。本研究中的SNCAS的开发与成功应用,有利于挖掘和监测不同胁迫下（如极端温度和高渗）Sn RK2的活性、ABA基础浓度和气孔运动状态,为未来作物的抗逆研究提供了有力的技术手段。