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车前药用始载于《神农本草经》,列为草之上品,以种子和全草入药。2010版《中国药典》将车前(PlantagoasiaticaL.)和平车前(PlantagodepressaWilld.)作为车前药材的植物来源。现代临床研究上,车前药材及其复方多用于治疗水肿、高血压和糖尿病等,具有良好的药用价值,得到了国内外的广泛关注。目前规定车前子的指标性成分为麦角甾苷和京尼平苷酸,车前草的指标性成分为大车前苷。然而,单一指标成分分析很难全面反应车前药材的质量全貌。另外,目前中药材市场上发现了有商家为谋取利润,用其他植物的种子如南葶苈子等代替车前子,或是添加到车前子中,对车前的临床用药安全性造成了很大的威胁。因此,亟需建立车前药材的代谢指纹图谱,对其化学成分进行全面的分析,为其质量评价提供依据。同时,车前草的药用部位及其采收时间也没有相关的报道,需进一步对车前草不同部位和不同发育时期的代谢产物进行研究,建立完善系统的质量评价方法,为药材合理采收提供科学依据。 本研究以液相色谱-质谱联用技术为核心技术建立了车前药材的代谢指纹图谱对不同基源车前药材中的化学成分进行解析,并对不同部位和不同生长时期的车前草中代谢产物的动态变化进行分析。主要研究内容如下: 1.基于UPLC/ESI-QTOF-MS结合MSE技术的车前子指纹图谱分析 利用UPLC/ESI-QTOF-MS结合MSE的技术,建立了车前子提的代谢指纹谱,共鉴定了108个化学成分,其中20个化合物经过对照品比对,其余的通过高分辨数据,二级质谱碎片与文献及在线数据库比对进行鉴定。主要包括11个苯乙醇苷类,23个黄酮类,18个胍类,9个萜类,28个脂肪酸类,4个有机酸类及其他类化合成分15个。其中通过质谱分析鉴定的18个胍类成分,大部分未在车前子中有报道,为新先导化合物开发提供了一定的依据。利用所建的车前子指纹图谱分析方法,比较了三种基源的车前属植物:车前(PlatnagoasiaticaL.),平车前(PlantagodepressaWilld.)和大车前(PlantagomajorL.)的种子化学成分的异同。通过比较分析可得三种车前属植物种子中黄酮类成分的差异较明显,plantagoside和pentahydroxyflavanone在大车前种子中含量丰富,而在车前种子和平车前种子中含量较低而很难检测到;对于平车前种子而言,ampelopsin3-glucoside,ampelopsin4-glucoside是其特征性成分,这四个黄酮类成分可以有效地区分车前、平车前和大车前的种子。 2.车前子胍类成分分析 通过对胍类化合物裂解规律的总结,发现此类化合物均能产生m/z84的碎片离子,因此可以将m/z84作为此类化合物的特征性碎片离子,利用三重四级杆质谱中母离子扫描(Parentionscan,PIS)模式,寻找所有可以产生该特征碎片的胍类化合物。通过母离子扫描分析,在车前子药材中共检测到34个胍类化合物,通过对保留时间和二级质谱裂解碎片分析,共推测了其中18个胍类化合物的结构,并总结了车前子药材中胍类化合物主要类型:(1)五元氮杂环上C-4有一支链;(2)C-4和N-1上各有一支链;(3)母核上的支链与母核连接而形成二环或三环的胍类化合物。 3.车前草次生代谢产物的动态变化 利用已建立的指纹图谱分析方法对不同部位和不同生长时期的车前草样本进行分析和代谢产物的鉴定,发现其主要含有四大类化学成分,分别为黄酮类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类和三萜类。聚类分析和主成分分析结果表明车前草不同部位中的化学成分差异较大,其中spiraeoside,cirsiliol,oleanolicacidacetate等可作为车前不同生长部位显著地化学标志物,提示这些成分可以作为车前草不同器官分化的化学标志物。此外,对车前草不同发育阶段的样品进行聚类分析和主成分研究发现,在发育过程中车前草中代谢产物的积累和转化呈现一定的趋势,主要的生长时期可以分为营养生长期,过渡期和繁殖生长期,其主要的潜在化学标志物有京尼平苷酸和麦角甾苷等。 进一步通过对车前草中化学成分的变化来确定车前草的最佳采收期,从产量和质量两个方面综合考虑,可以选择在开花期前后进行采收,因为在这段时期三萜类是含量最高的时期,苯乙醇苷类和环烯醚萜类也处于生长相对稳定的时期,而黄酮类化合物含量未达到最低,此外,此时车前草植株已生长完全,具有较高的经济价值。但具体的采收期还需要通过药效学实验以及对不同产地的样品进行分析后确定。