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胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor,GIST）起源于Cajal间质细胞及其祖细胞,是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤,可分为c-KIT基因突变型、PDGFRA型及wt-GIST。其中c-KIT基因突变型最常见,约占总病例数的80%,免疫组化表现为CD117阳性。GIST治疗首选R0切除,切缘距肿瘤2～3 cm。对于不能切除的局限性GIST,可在术前行分子靶向药物治疗缩小瘤体后再进行手术治疗。小分子选择性酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼（imatinib,IM）是GIST治疗的一线药物,可以和c-KIT及PDGFRA靶向结合,通过抑制酪氨酸激酶阻止其下游致癌基因启动。既可以作为高风险病例手术的辅助,也是GIST转移性疾病的主要治疗方法。c-KIT11号外显子突变的GIST对IM治疗敏感,9号外显子突变者少见,后者与PDGFRA基因D842V突变及wt-GIST患者常在一线治疗半年内产生原发耐药。即使早期对IM治疗敏感,半数患者2年内可观察到继发性IM耐药,并伴随疾病进展。这可能与c-KIT基因外显子13或17的新突变有关。二线药物舒尼替尼除可靶向结合c-KIT和PDGFRA受体外还可抑制VEGFR,对c-KIT基因9号外显子突变的GIST治疗效果极佳。但对于c-KIT 11号外显子及PDGFRA基因突变型GIST患者,一线治疗失败后,增加IM剂量或者改用舒尼替尼均无法获得满意效果。多靶点激酶抑制剂瑞戈非尼可抑制PDGFRA、KIT、VEGFR、TIE-2、RET、FGFR等,是伊马替尼与舒尼替尼失败后的GIST三线治疗药物,可用于c-KIT外显子17突变的三线治疗。除此之外,尼罗替尼、索拉非尼等可作为一、二线耐药后的替代选择,但不做常规推荐。尽管上述靶向药物的使用在GIST治疗中起初步效果,但耐药问题的发生不可避免,昂贵的药价也给患者经济带来沉重负担。因此,本实验期望寻找一种廉价、高效的药物可替代昂贵的进口分子靶向药物应用于临床治疗。从川楝树中提出的四环三萜类化合物川楝素（Toosendanin,TSN）最早应用于寄生虫病的治疗。已被证实对多种人类肿瘤细胞的生长起抑制作用,如白血病、胶质母细胞瘤、肝癌、胰腺癌、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、大肠癌等。TSN的广谱抗癌能力作用机制涉及广泛,然而TSN对GIST细胞生存是否有影响,国内外文献检索,均未见相关研究。因此,本研究选定GIST-T1细胞系作为研究对象,采用CCK-8、Hoechst 33342/PI染色、流式细胞学、qRT-PCR及Western Blot等实验技术,旨在探讨TSN对胃肠间质瘤细胞生长、凋亡的影响,并对其机制进行初步探索。第一部分:TSN对GIST-T1细胞增殖及凋亡的影响目的:探究TSN对GIST-T1细胞增殖及凋亡的影响。方法:设置实验分组为0、15、17、20、22、25、30 nmol/L的TSN,37℃、5%CO2条件下培养48h后,CCK-8测定各组450 nm波长处的光密度值,并计算细胞增殖抑制率。选择SPSS 20.0计算其半抑制浓度IC50。同样的方法检测72h细胞增殖抑制率,浓度设定为0、5、7、10、14、16、18、20 nmol/L。根据48h CCK-8结果将后续实验分为0、15、30 nmol/L TSN组,50 nmol/L伊马替尼作为阳性对照。通过流式细胞学及Hoechst 33342/PI荧光双染检测48h TSN对GIST-T1细胞凋亡及细胞周期的影响。结果:无论是48h或72h,与对照组比,TSN抑制了GIST-T1细胞增殖,当在一定浓度范围内增加TSN剂量时,GIST-T1细胞增殖抑制情况也加强。用SPSS计算其48h IC50为18.75 nmol/L;72h IC50为17.93 nmol/L。流式细胞学结果显示,与对照组相比,药物组均导致细胞凋亡水平增加,但15、30 nmol/L TSN、50 nmol/L IM 3组之间差异无统计学意义。Hoechst 33342/PI荧光双染佐证了这一结果,TSN与IM组镜下可见染色质固缩、呈强蓝色荧光的早期凋亡细胞。细胞周期结果显示,与对照组相比,15nmol/L TSN组S期细胞增多,但差异无统计学意义;30 nmol/L TSN可使细胞周期发生S期阻滞。结论:TSN可抑制GIST-T1细胞增殖并促进其凋亡。第二部分:TSN对GIST-T1细胞c-KIT表达的影响目的:探索TSN对GIST-T1细胞c-KIT表达的影响。方法:用0、15、30 nmol/L TSN、50 nmol/L IM体外干预GIST-T1细胞48h后,采用qRT-PCR及Western Blot实验检测c-KIT mRNA及其相关蛋白表达的影响。结果:qRT-PCR结果显示,TSN可下调c-KIT mRNA表达,但15 nmol/L TSN抑制效果不及30 nmol/L TSN和IM组,30 nmol/L TSN与IM组差异无统计学意义。Western Blot结果表明TSN明显抑制了c-KIT蛋白表达,30 nmol/L TSN比15 nmol/L TSN抑制作用更强。与对照组相比,TSN明显抑制p-c-KIT蛋白表达,30 nmol/L TSN抑制效果优于IM组。结论:TSN通过抑制c-KIT表达抑制GIST-T1细胞增殖,促进其凋亡。第三部分:TSN对GIST-T1细胞PI3K/AKT/mTOR表达的影响目的:探究川楝素对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响。方法:分组同第二部分,采用qRT-PCR检测PI3K、AKT、mTOR mRNA表达情况,Western Blot检测PI3K、AKT、mTOR及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达。结果:与对照组相比,PI3K、AKT、mTOR mRNA水平明显受抑制,且15 nmol/L TSN抑制效果优于IM组。Western Blot结果显示,与对照组相比,PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化形式蛋白表达明显被抑制。其中15 nmol/L TSN可显著抑制PI3K、mTOR、p-PI3K、p-mTOR及p-AKT表达,且对PI3K、mTOR、p-PI3K及p-AKT的抑制明显优于IM组。30 nmol/L TSN可明显抑制AKT表达。结论:TSN可抑制GIST-T1细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路激活。总结:TSN通过下调c-KIT表达,抑制GIST-T1细胞增殖并促进凋亡,可能通过PI3K/AKT/mTOR通路发挥作用。