前言:骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年中最常见的原发性骨恶性肿瘤之一,预后较差。目前临床上对骨肉瘤的治疗主要采用手术+化疗等综合治疗,使得患者的五年生存率较以前得到显著的提高。但是大剂量化疗带来的严重副反应以及多药耐药等问题使得骨肉瘤的治疗进展收到限制。azurin就是近年发现的一种很有前途的抗肿瘤生物蛋白之一。近期的研究证实azurin在体外和荷瘤裸鼠体内可选择性的诱导某些黑色素瘤和人乳腺癌等肿瘤细胞凋亡,同时发现azurin在体内诱导肿瘤细胞凋亡时,对机体无毒副作用。针对骨肉瘤容易产生化疗耐药的特点,我们使用细菌氧化还原蛋白azurin处理骨肉瘤细胞U20S后发现其具有明显诱导细胞凋亡的作用。而azurin的合成价格昂贵,我们通过基因工程的方式制备了表达azurin细菌株,通过摸索表达条件,达到最优化效果。并利用重组的azurin蛋白,证实了其诱导凋亡的活性,并探索p53基因在骨肉瘤细胞中对azurin诱导的凋亡有何影响。研究目的:1.我们通过基因重组的方式将azurin的cDNA插入DH5α菌株,并证实其表达azurin蛋白。通过探索不同的细菌表达条件,摸索最佳条件已使其表达最大化。2.p53在azurin诱导的凋亡过程中具有重要的功能,我们尝试使用具有不同p53基因的骨肉瘤细胞株来研究野生型和突变型p53是否影响azurin的抗肿瘤效果。3.通过使用基因干扰技术,更准确高效的探索p53基因与azurin之间是如何作用来产生抗肿瘤效果的。研究方法:1.我们使用已有的pqe30/azurin质粒,该质粒中含有azurin的cDNA,通过pGEM T质粒转染系统将其转染进入DH5 α菌株。通过改变细菌孵育的温度、时间以及诱导剂ITPG的浓度,探索最佳的表达条件;2.我们使用含有野生型p53的U20S细胞株以及含有突变型p53的MG-63细胞株来研究azurin对不同p53基因细胞的影响。我们通过使用已知作用浓度的azurin分别作用这两个细胞株不同时间,通过MTT来检测细胞存活,通过显微镜观察细胞形态,通过电子显微镜观察细胞超微结构变化,通过流式细胞仪检测细胞周期改变,通过RT-PCR检测凋亡相关基因表达以及通过western blot检测凋亡蛋白的表达水平。以此来研究不同p53表达水平下azurin作用的变化;3.我们选择具有野生型p53的U20S细胞株,使用构建的p53 siRNA来干扰细胞内p53的表达,再次使用azurin作用细胞,检测细胞周期,细胞形态,凋亡相关蛋白等表达,来定位azurin的作用靶点。研究结果:1.当外界条件不变时,使用pqe30/azurin质粒转染的DH5α菌株在37摄氏度,0.8ug/ml的ITPG作用5小时后表达效率最高;2.由于MG-63细胞株为p53突变型,而U20S为野生型,因此在azurin作用后两种有明显差异。Azurin可以显著诱导U20S发生凋亡,其凋亡相关的细胞形态,超微结构变化均被观察到,同时细胞周期发生明显变化,凋亡相关蛋白水平明显上升,特别是与p53相关的Bax和Bcl-2的变化最为显著。而在MG-63细胞中这些变化均不明显。说明,p53可能在azurin诱导骨肉瘤细胞凋亡中是有重要作用的。但是,由于azurin是一种蛋白分子,其在细胞内的作用较为复杂,因此需要更精确的研究来证实。于是,我们再一次设计实验。3.我们通过使用p53 siRNA+azurin处理U20S细胞,由于p53 siRNA能且只能抑制p53基因的表达,我们发现此时使用azurin处理后更多的细胞存活,较低的凋亡率,caspase-3活性、Bcl-2的上调程度、Bax的下调程度均低于对照组,即未使用p53 siRNA抑制组。在TUNEL检测中,p53 siRNA+azurin处理后的细胞阳性率低于对照组。说明p53 siRNA可以抑制由azurin引起的凋亡。由于使用p53 siRNA为瞬时转染技术,随着时间的推移,其功能会出现下降。因此我们观察到在作用72小时后,再次出现凋亡相关的反应。说明,azurin是和p53结合后才能发挥作用,它可以直接作用于上游而引发下游各相关产物的变化。研究还发现p53的调控细胞周期中可能出现类似癌基因的作用,而azurin的结合可以逆转这一功能。结论:本研究通过使用RNA干扰技术精确的将azurin的作用靶点定位于p53基因,证实了其确实通过与p53结合产生作用,解释了 azurin在一些细胞株上诱导凋亡作用较弱的原因,并发现p53在野生型细胞株中类似癌基因的作用,为进一步探索肿瘤的发生及基因治疗开拓道路。