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研究背景与目的:急性动脉血栓形成通常是由不稳定的动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀所引发的凝血级联反应,往往具有症状隐匿和瞬间突发的特点,患者常以致死性血栓形成事件为首发症状,具有较高的致死率和致残率。在血栓形成早期病变局部活化的凝血酶含量升高,有研究将活化的凝血酶作为血栓形成的早期分子标志物,对凝血酶活性进行检测,实现血栓形成的分子成像。近年来随着分子影像学（Molecular imaging）和纳米生物技术的发展,心血管等诸多研究领域已经实现了对疾病分子标志物的在体可视化。将血栓形成过程中表达发生显著变化的分子标志物（例如凝血酶、纤维蛋白、活化的血小板等）作为靶点,在活体状态下监测标志物的动态变化来反映疾病的病理演变过程,不仅为血栓的早期可视化诊断提供了新的思路,也为治疗效果的评估提供了可能性。本研究基于可被凝血酶特异性识别并发生酶切反应的凝血酶响应肽（Thrombin reactive peptide,TRP）、超顺磁性氧化铁（Superparamagnetic iron oxide,SPIO）和菁染料Cy5.5琥珀酰亚胺酯（Cy5.5 NHS）,构建了一种凝血酶智能响应型纳米探针,实现凝血酶活化的在体可视化,将有助于血栓形成的早期识别和及时干预。研究方法:1.Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针的制备、表征和体外研究:1)将Cy5.5 NHS、TRP和SPIO共价偶联构建Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针,并对探针的理化性质进行表征。2)CCK-8实验分析Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC）增殖的影响;3)向等体积的Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针溶液中加入不同浓度的凝血酶溶液,应用IVIS Spectrum成像系统观察各组探针荧光信号强度,并进行定量分析;4)向ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction,STEMI）患者血浆和健康受试者血浆中分别加入等体积的Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针,与血浆共孵育,应用IVIS Spectrum成像系统观察各组血浆中探针荧光信号强度的差异,并进行定量分析;5)应用9.4T MRI成像系统对不同浓度的Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针进行MRI T2成像。2.Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针的在体成像和组织病理学研究:1)10%Fe Cl3化学损伤法建立实验组小鼠左颈总动脉（Left common carotid artery,LCCA）血栓模型,并应用颈部血管多普勒超声成像和组织切片苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,H＆E）染色验证血栓模型制备成功;对照组小鼠同侧LCCA假手术处理;2)应用IVIS Spectrum小动物3D活体成像系统和9.4T小动物活体MRI成像系统对实验组（血栓模型+尾静脉注射纳米探针）和对照组（假手术+尾静脉注射纳米探针）小鼠颈部进行近红外荧光成像和磁共振成像;3)分离获取实验组小鼠两侧颈动脉,进行免疫荧光染色,明确Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针在血栓形成部位的靶向性;4)分离获取经尾静脉注射纳米探针和未注射纳米探针小鼠的主要脏器进行H＆E染色,分析Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针的组织相容性;5)分离获取实验组小鼠主要脏器并进行离体近红外荧光成像,观察不同时间点荧光信号强度;对主要脏器进行普鲁士蓝染色,探究Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针的生物分布和主要代谢途径。研究结果:1.Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针理化性质表征和体外研究:1)SPIO呈球形,粒径均一,分散度好,未观察到明显的团聚现象,平均粒径为9.8±2.7nm;Zeta电位为-9.84m V;SPIO磁滞曲线通过原点,剩磁为零,饱和磁化强度为53.8emu/g;TRP和SPIO-TRP样品在291nm波长处出现特征性吸收峰。2)HUVEC细胞与不同浓度的探针（0～200μg/ml）共孵育后,各组细胞存活率的差异无统计学意义（P＞0.05）;3)相较于空白对照组,实验组加入外源性凝血酶后,探针的荧光信号显著增强;而阴性对照组（凝血酶浓度为50U/m L）未观察到探针荧光信号的增强;探针荧光强度与加入凝血酶后反应时间的关系提示,20min前探针荧光强度随反应时间的延长快速增强,20min后探针的荧光强度基本稳定;Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针T2加权像的MRI信号随着铁离子浓度的增加逐渐变短,且信号的衰减程度与Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针中铁离子浓度呈线性相关（R~2=0.985）;4)相较于健康受试者,STEMI患者血浆中的探针荧光信号显著增强,而经血运重建患者血浆中的探针荧光信号强度较健康受试者无显著差异。2.Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针的在体成像和组织病理学分析:1)血栓模型小鼠颈部血管多普勒超声成像中可观察到左侧颈总动脉腔内存在新鲜血栓的低回声信号,在模型建立24h后几乎不再观察到血管腔内多普勒血流信号;同时,对颈动脉组织切片进行H＆E染色,可观察到原位血栓形成;2)实验组小鼠尾静脉注射Cy5.5 NHS-TRP-SPIO纳米探针后,颈部和离体LCCA均可观察到明显的荧光信号,而在对照组未观察到明显的荧光信号;与对照组相比,实验组小鼠颈动脉管腔内可观察到MRI T2长信号,在尾静脉注射探针后观察到颈动脉管腔内的MRI T2信号变短;3)颈动脉组织切片免疫荧光染色提示,与对侧颈动脉相比,血栓造模侧颈动脉管腔内凝血酶含量明显升高,且凝血酶浓集部位和血栓形成部位基本吻合;4)主要脏器组织切片H＆E染色提示,注射Cy5.5 NHS-TRP-SPIO后,未观察到明显的组织损伤或炎症相关的病理现象;5)尾静脉注射Cy5.5 NHS-TRP-SPIO 10min后,主要脏器近红外荧光成像中观察到肾脏、肝脏和心脏的明显荧光信号,尾静脉注射Cy5.5 NHS-TRP-SPIO NPs 6h后,可观察到肝脏和心脏的荧光信号显著降低,而肾脏的荧光信号仍然很强;离体脏器的铁离子含量分析发现,铁离子在肾脏、脾脏和肝脏中沉积,且尿液中的铁离子含量较高;组织切片普鲁士蓝染色中观察到,肾脏、脾脏和肝脏中有明显的铁颗粒沉积。研究结论:1.成功构建了凝血酶智能响应型纳米探针（Cy5.5 NHS-TRP-SPIO）;2.纳米材料呈球形,粒径均一、分散良好,稳定性较好,生物相容性较好;3.体外研究证实Cy5.5 NHS-TRP-SPIO NPs具有较好的凝血酶响应性和荧光成像效果,且MRI T2成像对比度较好;4.应用10%Fe Cl3溶液化学损伤法成功构建了小鼠颈动脉血栓模型;5.在体荧光成像和磁共振成像验证了Cy5.5 NHS-TRP-SPIO NPs对血栓形成部位的靶向性,荧光成像灵敏度较高,磁共振成像对比度较高。综上所述,本研究成功构建了一种凝血酶智能响应型纳米探针,能够实现对血栓局部活化的凝血酶的动态识别和对血栓形成的在体可视化,为血栓性疾病的分子成像和早期识别提供了新策略。