5-羟基色氨酸(5-HIP)是动物体内合成血清素与褪黑素的前体,它们对情绪与行为的控制,以及睡眠、痛觉、体温等生理功能具有重要的调节作用,已被成功用于抑郁症、失眠和偏头痛等疾病的治疗。但因为缺乏有效的生物化学合成方法,5-HTP目前主要是从加纳籽(Griffonia simplicifolia)中提取获得,其产量受地域与季节的影响较为严重。本文通过代谢途径的表达调控、关键酶的改造表达、以及基因组整合等代谢工程手段,利用大肠杆菌构建高效生物合成5-HTP的细胞工厂。首先,将人源色氨酸羟化酶(TPH)导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,研究了 TPH的表达特性与酶学活性。利用重组表达细胞和体外添加辅酶四氢生物蝶呤(BH4),以L-色氨酸为底物合成5-HTP。TPH需要以BH4作为辅酶实现对L-色氨酸的羟化。为了避免体外添加昂贵的BH4,本文利用双质粒表达体系将人源BH4合成与再生途径导入大肠杆菌,与TPH共表达,成功构建了完整的色氨酸羟化途径。重组大肠杆菌可以利用自身合成的BH4,能羟化2g/LL-色氨酸产生1.24 g/L5-HTP。进一步将色氨酸合成途径引入重组大肠杆菌中实现了 5-HTP的生物合成,重组菌株HTP4-1在M9Y培养基中的5-HTP产量为22.4mg/L。经过培养基与培养条件的优化,使5-HTP产量进一步提高了 13倍,达到314.8 mg/L,L-色氨酸浓度3971.8 mg/L。利用代谢工程方法平衡细胞中各途径的代谢通量是提高目标产物产量的关键。HTP4-1菌种在发酵过程中L-色氨酸的积累远远超过5-HTP的产量,其代谢通路间存在严重的不平衡,影响了 5-HTP的产量。为了平衡各代谢通路的活性,降低中间产物L-色氨酸的积累,提高5-HTP产量,本文将5-HTP合成途径划分为L-色氨酸的合成,BH4的合成,BH4的再生与L-色氨酸的羟化四个模块,分别对其进行了分析与调节。通过降低色氨酸合成模块的质粒拷贝数,减少了中间产物L-色氨酸的积累。为了提高TPH对L-色氨酸的羟化活性,通过酶学改造,删除了其N端调控域和C端四聚体结构域,提高了 TPH的表达量与胞内酶活。经比较分析,BH4合成与再生系统的表达强度过高,对细胞生长造成了较大的负担,通过将BH4合成与再生模块中的T7启动子-单顺反子表达方式改为多顺反子表达,并调节其启动子强度,在保证BH4供给的同时,降低了蛋白表达对细胞造成的生长负担。经过改造的重组菌株HTP101-LMT的5-HTP产量1.29 g/L,提高了 3.1倍。色氨酸浓度降低至1.66 g/L。补料分批发酵考察其5-HTP生产潜力,细胞密度最高达OD600=94.6,5-HTP产量进一步提高至5.1 g/L,为文献报道最高产量,L-色氨酸的积累量为8.5 g/L。重组菌株HTP101-LMT在发酵后期色氨酸羟化质粒丢失严重,导致其羟化活性降低,影响了 5-HTP的持续积累。本文将L-色氨酸合成途径整合到大肠杆菌基因组,将双质粒系统改为单质粒表达,进一步降低了 L-色氨酸的积累,提高了色氨酸羟化质粒的稳定性,并通过对羟化质粒拷贝数调节提高了 5-HTP的产量。aroHfbr基因负责L-色氨酸合成的第一步反应,对其表达强度的调控可以对L-色氨酸以及5-HTP的合成效率进行有效调节。本文通过启动子工程调控aroHfbr基因的表达强度,将L-色氨酸的浓度有效的控制在较低的水平,并帮助提高了 5-HTP的产量。重组菌株TRPmut/pSCHTP-LMT在摇瓶中的5-HTP产量为1.61 g/L,与HTP101-LMT双质粒菌株相比提高了 24.8%。同时L-色氨酸浓度降为0.25 g/L,发酵液中5-HTP与L-色氨酸的浓度比由0.78:1提高至6.44:1,为后续的分离纯化提供了方便。在此过程中,本研究发现aroHfbr的同工酶基因aroF、aroG对L-色氨酸的合成也有较大的影响。并通过在基因组中分别敲除aroHfbr、aroF、aroG三条同工酶或其组合,考察了三条基因在L-色氨酸及芳香族氨基酸合成中的重要作用。结果显示aroHfbr、aroG、aroF在细胞中的表达活性依次降低,对L-色氨酸合成的影响也依次减弱。