黄芩苷是清热燥湿药黄芩中一种主要的、具有显著生物活性的黄酮类化合物,可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化,产生相应的抗炎作用,但目前对于其具体的作用靶点研究尚不明确。CD14在LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路活化中,不仅起到了递送LPS的作用,还介导细胞膜表面TLR4的内吞,在LPS诱导的炎症反应中起增敏作用。基于前期预实验发现黄芩苷能够抑制CD14的表达,故本课题以CD14为主要探究对象,采用LPS刺激的RAW264.7、HT-29、HepG2细胞,腹腔注射LPS的急性炎症小鼠和DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠为研究模型,加以沉默CD14的RAW264.7细胞一同探讨黄芩苷在抑制TLR4/NF-KB信号通路中的具体作用机制。目的:本研究主要目的在于通过各类细胞、动物炎症模型证明黄芩苷是通过调控CD14分子的表达来影响LPS-TLR4/NF-κB信号通路的激活,进而深入阐明黄芩苷的抗炎机制,为其他抗炎药物的开发与抗炎机制的研究提供参考依据与方法。方法:1.黄芩苷预处理与后处理对LPS诱导的RAW264.7炎症反应的影响该部分首先采用MTT、Griess法筛选出既有抗炎效果且又对细胞活性无抑制作用的黄芩苷给药剂量。再以1μg/mL的LPS刺激造模,建立RAW264.7细胞炎症模型,采用ELISA法检测黄芩苷预处理或后处理对细胞分泌IL-6,TNF-α的影响,流式细胞术检测对细胞表面MHC-Ⅱ表达的影响,WB检测对细胞MyD88、NF-kB p65蛋白表达的影响。2.黄芩苷预处理通过抑制CD14的表达减轻LPS诱导的TLR4/NF-KB信号通路的活化基于前期抗炎药效以及对炎症信号通路蛋白的研究,再结合CD14,TLR4是细胞接受LPS或LPS-LBP复合物刺激并传导炎症信号的起点,因此,该部分首先采用流式细胞术检测黄芩苷预处理或后处理对TLR4和CD14的影响,观察是否和前期实验结果一致,以缩小探讨黄芩苷抗炎作用靶点的范围,寻找可能的突破口。紧接着将黄芩苷与RAW264.7细胞进行共孵育24 h,利用流式细胞术检测黄芩苷对RAW264.7细胞表面CD14和TLR4表达的直接影响,以及使用RT-PCR检测对CD14 mRNA的影响。再进行沉默CD14的RAW264.7细胞（RAW264.7-shCD14）的构建,并采用流式细胞术检测细胞表面CD14表达情况以确定沉默细胞株是否构建成功。采用流式细胞术与 WB 检测 RAW264.7-shCD14 表面 F4/80,TLR4 的表达验证 RAW264.7-shCD14的细胞状态是否稳定;采用Griess法梯度筛选RAW264.7-shCD14细胞的LPS造模剂量（0.01,0.1,1,10,100,1000μg/mL）;采用 Griess、ELISA、WB 法检测黄芩苷对LPS刺激的RAW264.7-shCD14细胞释放NO、IL-6以及对p-NF-KB p65表达的影响。3.黄芩苷预处理对LPS诱导的HT-29、HepG2细胞炎症反应以及CD14的影响该部分采用LPS诱导的HT-29、HepG2细胞为研究模型,探讨黄芩苷的抗炎效果以及降低CD14的作用是否在其他细胞株上同样适用。首先,同样采用MTT法检测黄芩苷对HT-29、HepG2细胞活性的影响;采用流式细胞术与WB法检测黄芩苷对细胞表面CD14的影响,采用WB法检测黄芩苷对细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响。4.黄芩苷预处理对不同炎症模型小鼠的抗炎作用以及CD14的影响该部分采用腹腔注射LPS诱导的急性炎症小鼠和DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠作为实验模型,进行黄芩苷药效与作用机制探究。即选用SPF级的Balb/c与C57BL/6小鼠,雄性,18-22g,根据体重采用随机分层方式分为正常组（Control）、模型组（LPS）和黄芩苷组（Baicalin）,共3个组。Balb/c小鼠在预给药灌胃黄芩苷3天后,腹腔注射LPS建立急性炎症模型,造模后,每4 h进行一次体重记录并观察小鼠毛发、腹泻等状态。24 h后取材并进行指标检测。C57BL/6小鼠则自由饮用3%DSS 6天,复制溃疡性结肠炎模型,在此期间同时灌胃黄芩苷。第7天各组停止饮用DSS,结束造模,换为蒸馏水。小鼠继续灌胃黄芩苷或蒸馏水至第10天。第11天,取材并进行指标检测。结果:1.黄芩苷预处理可以缓解LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,但是后处理则无此作用MTT,Griess法筛选后,确定12.5、25、50 μM为实验的低、中、高三个剂量。经LPS造模,RAW264.7细胞分泌的炎症因子NO,IL-6,TNF-α以及细胞表面分子MHC-Ⅱ的表达均明显升高（P<0.001）,且TLR4/NF-κB炎症信号通路被激活,MyD88,NF-κB的表达量显著上升（P<0.05）。与模型组相比,预给药黄芩苷可以显著降低NO,IL-6,MHC-Ⅱ的表达（P<0.05）,缓解TLR4/NF-κB信号通路活化,降低通路蛋白的表达,但是后给药黄芩苷无抑制作用,且预给药与后给药之间存在显著性差异（P<0.001）。2.黄芩苷预处理通过抑制CD14的表达减轻LPS诱导的TLR4/NF-KB信号通路的活化2.1黄芩苷预处理可以降低RAW264.7细胞TLR4和CD14的表达,但是后处理不能与前期实验结果一致,LPS能够明显增加细胞表面TLR4和CD14的表达,预给药可以缓解二者的表达上升,且差异具有统计学意义（P<0.001）,但是后处理不能达到相应的效果。并且,预给药的缓解作用同样具有剂量依赖性。2.2黄芩苷可以降低RAW264.7细胞CD14的表达但对TLR4没有影响黄芩苷与RAW264.7细胞共孵育发现,黄芩苷可以显著降低细胞表面CD14的表达（P<0.001）,且呈一定的剂量依赖性,但是对TLR4的表达并无明显的影响,且对CD14 mRNA的表达有明显的抑制作用（P<0.05）。2.3黄芩苷预处理不能抑制LPS诱导的CD14沉默细胞炎症反应该部分成功构建了沉默CD14基因RAW264.7细胞（RAW264.7-shCD14）,且验证细胞表面CD14以及CD14 mRNA的表达率均显著下降,而细胞表面F4/80以及TLR4的表达并没有发生明显变化。在0.01、0.1、1、10、100、1000 μg/mL中筛选出1000 μg/mL作为RAW264.7-shCD14细胞的造模剂量。LPS刺激后,细胞NO,IL-6的分泌以及p-NF-κB p65的表达均显著升高（P<0.01）,但是预给药黄芩苷并没有有效降低其释放,说明当CD14沉默时,将影响黄芩苷抗炎作用的发挥。3.黄芩苷预处理可以缓解LPS诱导的HT-29、HepG2细胞炎症反应以及降低CD14的表达MTT法检测同样发现12.5、25、50 μM三个剂量对HT-29、HepG2细胞无明显细胞毒性作用,且可以降低细胞表面CD14的表达;在LPS刺激后,HT-29、HepG2细胞表面CD14表达明显上升,预给药黄芩苷可以缓解,高剂量尤为明显（P<0.001）。黄芩苷同样可以抑制HT-29、HepG2细胞TLR4/NF-κB通路的激活,使得MyD88,p-NF-kB,NF-κB通路蛋白表达降低（P<0.05）,说明黄芩苷对CD14的抑制作用以及抗炎效果在HT-29、HepG2细胞株上同样适用。4.黄芩苷预处理对不同炎症模型小鼠的抗炎作用以及CD14的影响腹腔注射LPS造模4小时后观察发现,小鼠伏状,双眼微闭,毛发失去光泽,出现腹泻;而预给药黄芩苷组状况明显较好,少许小鼠伏状闭眼,有2-3只活跃,少数腹泻。与正常组比较,各组注射了 LPS的小鼠体重均明显下降。在16 h后,模型组继续下降,但黄芩苷组出现些许上升,且在24 h与模型组之间存在显著性差异（P<0.05）。取材称量脾脏胸腺湿重,计算发现黄芩苷具有明显恢复炎症小鼠免疫器官指数的作用。免疫组化检测小鼠结肠CD14、IL-6的表达则发现,与正常组相比,模型组CD14的表达明显升高,且分布广泛,而预给药黄芩苷组其表达出现减少,说明黄芩苷能缓解急性炎症小鼠结肠炎症反应,且能够降低CD14表达。DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠出现了明显的缩短,粪便呈稀状,甚至便血,而黄芩苷组有明显改善,长度统计有显著性差异（P<0.05）,脾脏指数也有一定恢复。HE染色显示,DSS造模后小鼠结肠黏膜有轻微水肿并增厚糜烂,固有腺体消失,呈溃疡状等,黄芩苷组虽还存在轻微水肿,但是腺体完整,上皮相对完整,糜烂和溃疡明显减少。免疫组化检测小鼠结肠CD14、IL-6的表达同样发现,与正常组相比,CD14、IL-6在模型组小鼠结肠的表达明显增加,而黄芩苷组表现出一定缓解。因此,黄芩苷同样能够能缓解溃疡性结肠炎小鼠的炎症反应,且降低CD14表达。结论:1.黄芩苷预处理通过缓解TLR4/NF-κB信号通路的活化而抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,而后处理未见此作用;2.黄芩苷预处理缓解RAW264.7细胞TLR4/NF-κB信号通路的活化是通过抑制细胞膜表面CD14分子表达而实现的。这一作用机制在LPS诱导的HT-29、HepG2细胞炎症模型中同样得到验证。3.体内实验中,同样证明黄芩苷预处理可以降低不同炎症模型小鼠结肠CD14的表达,进而缓解炎症状况。总之,结果证明黄芩苷预处理抑制LPS所诱导的炎症反应其作用机制是:通过抑制CD14表达而缓解TLR4/NF-κB信号通路活化。