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目的胶原糖基化修饰对肝损伤的影响,尚不完全明确。本研究旨在探究Glt25D1（Collagen beta（1-O）galactosyltransferase 1,Colgalt1/Glt25D1）和 Glt25D2（Colgalt2/Glt25D2）介导的Glcα1,2Galβ1-糖基化修饰在对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）诱导的急性药物性肝损伤中的作用及可能机制。方法1.小鼠的生存率测定随机抽取6～8周雄性且无特定病原体的Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-小鼠及相同周龄的野生型（Wild type,WT）小鼠,体重为（22±2）g,随机分8组,每组10只,实验组:禁食 15 h+APAP WT 组、禁食 15 h+APAP Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-组、不禁食+APAP WT组、不禁食+APAP Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-组,对照组:禁食15 h+生理盐水WT组、禁食15 h+生理盐水Glt25D1ΔhpGlt25D2-/-组、不禁食+生理盐水WT组、不禁食+生理盐水Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-组,腹腔内注射APAP,剂量为750 mg/kg,然后记录各组小鼠的生存情况,绘制生存曲线。2.小鼠急性药物性肝损伤模型体内实验随机抽取6～8周雄性且无特定病原体的Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-小鼠及相同周龄的WT小鼠,体重为（22±2）g,分为WT对照组和Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-对照组、WTAPAP组和Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-APAP组,每组8只。禁食15 h后,实验组通过腹腔内注射APAP,剂量为500 mg/kg,对照组给予相同剂量生理盐水注射。分别于造模6 h处死小鼠后取材,分离血浆,标准酶法检测谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）水平;留取肝组织标本,HE染色观察肝组织病理学改变,并采用SUZUKI评分量化,评估肝脏损伤程度;qRT-PCR检测肝组织中IL-1、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β等细胞因子基因转录水平;Western Blot检测肝组织中 Glt25D1、Glt25D2、GRP78、CHOP、ATF6、IRE1α、p-IRE1α、eIF2α、p-eIF2α以及 cleaved caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 蛋白的表达情况;线粒体与胞浆蛋白分离后Western Blot检测细胞色素c的表达量。3.小鼠急性药物性肝损伤模型体外实验随机抽取6～8周雄性且无特定病原体的Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-小鼠及相同周龄的WT小鼠,体重为（22±2）g,分离纯化原代肝细胞。将获得的原代肝细胞按照1×106个/ml接种到六孔板上,在37℃的5%CO2湿化环境中培养24 h后,用衣霉素（Tunicamycin,Tm）（10μg/ml）和 APAP（500 μg/ml）处理原代肝细胞。刺激 6h 后,用细胞活性检测法（cell counting kit-8,CCK-8）检测细胞活力变化;细胞凋亡检测试剂盒测定caspase-3/7活性程度;提取细胞总RNA及定量逆转录PCR,检测肝原代细胞中IFN-γ、IL-4、IL-6、TNFα、IL-10、TGF-β等细胞因子基因转录水平;提取细胞总蛋白,Western Blot 检测肝原代细胞中 Glt25D1、Glt25D2、GRP78、CHOP、ATF6、IRE 1α、p-IRE1α、eIF2α、p-eIF2α以及 cleaved caspase-12、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、PCNA、P-Akt蛋白的表达情况;线粒体与胞浆蛋白分离后Western Blot检测细胞色素c的表达量。结果1.小鼠的生存状态变化注射死亡计量APAP,Glt25D1和Glt25D2敲低后,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-的死亡率明显高于WT小鼠。禁食+APAP组小鼠的死亡率明显高于不禁食+APAP组,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-小鼠与WT小鼠生存时间存在差异有统计学意义（p<0.05）。对于不禁食+APAP的实验组,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-组小鼠的死亡率明显高于WT组小鼠（p<0.01）;对于禁食+APAP的实验组,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-组小鼠的死亡率明显高于WT组小鼠（p<0.05）。空白对照组无明显变化。2.小鼠肝脏损伤的差异小鼠肝功能变化及肝组织HE染色提示,Glt25D1和Glt25D2敲低,经APAP诱导后肝损伤加重。APAP造模前后,与对照组小鼠相比,造模组小鼠ALT、AST明显升高;与WT造模组小鼠相比,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-小鼠ALT、AST升高更加明显（p<0.001）。肝组织HE染色示:WT对照组和Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-对照组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞在中央静脉周围呈放射状排列,未见明显损伤。APAP造模6h后,WT造模组小鼠肝小叶结构尚可,可见肝细胞水肿及点状坏死灶和炎症细胞浸润等;Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-造模组小鼠肝小叶结构紊乱,可见大片坏死灶,门管区炎症细胞浸润明显,其中炎症细胞以中性粒细胞为主,还有单核细胞、淋巴细胞。与WT造模组小鼠相比,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-造模组小鼠肝脏坏死面积更广、汇管区炎性细胞浸润更显著,SUZUKI评分明显更高。3.小鼠肝脏组织及肝原代细胞内质网应激相关蛋白表达量变化在APAP诱导肝毒性的模型中,Glt25D1和Glt25D2敲低可能加重内质网应激。体内实验和体外实验Western Blot均显示,与对照组相比,造模组的内质网应激标志蛋白GRP78及其下游相关蛋白CHOP、ATF-6、p-IRE1α、p-eIF2α的表达量均显著升高,凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3 表达显著上调。尤为注意的是,与WT造模组小鼠相比,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-造模组小鼠内质网应激相关蛋白表达量和凋亡相关蛋白表达量明显升高。同时发现,与WT对照组相比,WT造模组小鼠Glt25D1和Glt25D2表达上调。分离线粒体与胞浆蛋白显示,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-造模组释放入胞浆中的线粒体的细胞色素c明显更多。4.内质网应激诱导的细胞凋亡和炎症反应Glt25D1和Glt25D2敲低后,肝细胞对内质网应激诱导的凋亡和炎症反应更加敏感。CCK8细胞活性检测试验和caspase-3/7细胞凋亡检测试验显示,经APAP刺激后,与WT原代肝细胞相比,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-原代肝细胞存活率较低,凋亡较多;Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-对照组细胞与WT对照组之间比较差异无统计学意义。此外,q-PCR结果提示,在APAP的诱导下,Glt25D1和Glt25D2敲低的细胞中有更多的IL-6和TNF-β表达。总之,经APAP诱导后,Glt25D1ΔhepGlt25D2-/-原代肝细胞出现了更严重的炎症反应和凋亡。结论Glt25D1和Glt25D2基因敲低可能通过促进内质网应激加重APAP诱导的小鼠急性药物性肝损伤。