本论文以一株丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata) CCTCC M202019为模型,研究了高渗胁迫对其生理生化特性及丙酮酸产量的影响。采用表达谱芯片、实时定量PCR(qPCR)、蛋白质二维电泳、同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)、关键酶活性测定和重要代谢产物分析等系统生物学方法,深入研究了光滑球拟酵母在高渗胁迫条件下,胞内代谢与调控网络在转录水平、蛋白质水平的变化情况,并在此基础上提出3种策略,有效强化了光滑球拟酵母抵御高渗胁迫的能力。主要研究结果如下:1)采用表达谱芯片技术,研究了光滑球拟酵母细胞在不同渗透压条件下(860 mOsmol/kg、1765 mOsmol/kg、2603 mOsmol/kg和3324 mOsmol/kg)的转录水平变化情况。结果表明,在高渗透压条件下,表达量大幅度提高的基因主要包括一些与细胞壁、细胞膜合成相关的基因以及细胞膜上的信息素蛋白基因。中心代谢途径(即糖酵解途径、三羧酸循环和氧化磷酸化途径)整体表现为显著上调,特别是参与ATP和NADH合成的相关基因。此外,对可能作为相容性溶质的氨基酸,如谷氨酸、脯氨酸、精氨酸的合成代谢途径的分析表明,脯氨酸和谷氨酸合成途径中的酶转录水平均有一定程度的提高,但是幅度不大;而精氨酸分解途径中的尿素羧化酶转录水平发生显著下调,其转录水平下降至1/100以下。2)通过二维电泳和iTRAQ技术对不同渗透压条件下细胞内的蛋白质组差异进行分析。发现在高渗条件下表达水平大幅上调的蛋白主要是一些核糖体亚基蛋白、控制细胞分裂的蛋白、DNA拓扑异构酶和一些转运蛋白等。通过对中心代谢途径和能量代谢途径的分析发现,蛋白质表达量与基因转录水平在全局层面上有较高的相关性。此外,随着发酵液渗透压的提高,超氧化物歧化酶和富脯蛋白的表达量逐渐增加,前者可能和高渗环境下活性氧簇的积累有关,而后者可能与胞内脯氨酸的积累有关。3)研究表明脯氨酸可以作为相容性溶质提高光滑球拟酵母在高渗条件下的细胞生长能力。丙酮酸发酵过程中,发酵液逐渐积累丙酮酸钠,渗透压从发酵初始的860 mOsmol/kg提高到发酵末期的2603 mOsmol/kg,对细胞生长和丙酮酸的进一步积累都有显著抑制。当培养基渗透压为2603 mOsmol/kg时,添加1.0 g/L脯氨酸作为相容性溶质,可使细胞生长提高59.0%。在丙酮酸发酵过程中28 h时,向发酵液中添加1.0 g/L脯氨酸,丙酮酸浓度,生产强度和产率分别提高22.1%、38.4%和14.3%。上述结果表明,光滑球拟酵母可以吸收外源脯氨酸作为相容性溶质,抵御渗透压胁迫,并可显著增强丙酮酸生产能力。外源添加脯氨酸提高高渗条件下光滑球拟酵母细胞生存和生长能力,为后续利用发酵过程优化手段或代谢工程策略提高类似微生物生产有机酸能力提供了可靠的事实与理论依据。4)通过外源添加和自身合成两种方式,考察了精氨酸胞内积累对高渗条件下光滑球拟酵母细胞生长和丙酮酸生产的影响。与未添加精氨酸的对照组相比,在培养基渗透压分别为2,603 mOsmol/kg和3,324 mOsmol/kg时,添加0.5 g/L精氨酸可使细胞干重分别提高173.7% (5.2 g/L)和121.4% (0.31 g/L)。基因芯片分析和定量PCR结果表明,在高渗条件下,精氨酸分解代谢途径中的酶的转录水平受到强烈抑制,特别是尿素羧化酶,而合成途径中的酶转录水平有所提高,结果导致精氨酸的显著积累。在此基础上,在光滑球拟酵母中过量表达精氨酸合成途径中的两个关键酶——谷氨酸N-乙酰转移酶和N-乙酰谷氨酸激酶,可使胞内精氨酸含量增加,使得过量合成精氨酸菌株的高渗耐受能力相比出发菌株有显著提高。5)在光滑球拟酵母中过量表达来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) NZ9000的合成水NADH氧化酶基因noxE,研究其对高渗条件下细胞生长的影响。过量表达合成水的NADH氧化酶,显著降低了细胞中NADH/NAD~+的比例,而水形成相关途径中的一些酶活性提高,使胞内与水合成相关途径的代谢流量显著上升,最终胞内合成水的含量升高。过量表达NADH氧化酶可以使胞内水含量提高大约60 mg胞内水/g菌体干重。流式细胞技术分析结果表明,工程菌平均细胞体积比出发菌株大9.5%。上述结果表明,通过调控微生物胞内水合成途径,可以显著提高细胞的渗透压适应能力。另外,由于高NaCl浓度会增加细胞活性氧簇(ROS)浓度,而NADH氧化酶的表达可以减少ROS的产生,也是其可以提高光滑球拟酵母抵御渗透压胁迫的能力一个关键原因。