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目的:牙周炎是一种由牙菌斑生物膜为始动因子引起的口腔常见感染性疾病,细菌及其产物直接或间接对牙周支持组织造成破坏,如牙龈结合上皮在根面附着高度不断降低,从冠方与牙面脱离,牙槽嵴顶吸收增强,骨量减少,牙齿因失去支持力松动度逐渐增大,最终自然脱落或被拔除,导致牙齿丧失。牙周感染与全身疾病也息息相关,牙周炎可通过直接感染、牙周细菌经血行扩散或者细菌及产物引发的宿主免疫炎症反应的方式,成为心脑血管疾病、糖尿病、呼吸系统疾病的危险因素,威胁患者全身健康。因此,控制牙周炎症、恢复牙周组织功能、再生牙周组织是牙周病治疗的主要目标。然而,如何找到促进牙周组织再生的有效途径是亟待解决的关键问题。近年来,以干细胞为基础的再生医学取得了长足的进展。本组前期研究发现,调节表观遗传修饰能显著增强牙周膜干细胞的成骨分化,为牙周膜干细胞治疗牙周病的临床应用提供了可能。本研究初步探讨表观调控因子ASXL2介导牙周膜干细胞定向分化的作用及其表观遗传学机制,为牙周膜干细胞促进牙周组织再生提供基础研究依据和新思路。本研究旨在探究ASXL2敲低后对牙周膜干细胞增殖及凋亡情况的影响,对牙周膜干细胞成骨和成脂分化能力的影响,以及其调控作用的表观遗传机制。方法:1.设计并合成靶定ASXL2的sh RNA,构建慢病毒表达载体,包装慢病毒并转染牙周膜干细胞,筛选ASXL2敲低的牙周膜干细胞2.通过流式细胞术分析牙周膜干细胞相关标志物抗原。3.采用CCK8、Annexin V法测试牙周膜干细胞的增殖活性、凋亡情况。4.采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色方法检验早期和晚期成骨分化能力。5.通过Real Time PCR检测成骨基因ALP,RUNX2,COL1A1,OCN和成脂基因DGAT1表达变化。6.通过蛋白质免疫印迹分析法以评估成骨蛋白OCN,组蛋白修饰H2AK119ub,H3K4me3和H3K27me3的总细胞水平变化。7.通过RNA-seq高通量测序分析ASXL2对人牙周膜干自我更新和分化能力的调控机制。结果:1.敲低ASXL2的人牙周膜干细胞在体外经成骨培基诱导7天后,与对照组相比,碱性磷酸酶染色变浅,碱性磷酸酶活性降低;成骨诱导14天后,茜素红染色着色变浅,钙离子浓度显著降低。2.qRT-PCR显示,体外成骨诱导后,ASXL2敲低的人牙周膜干细胞成骨相关基因COL1A1、RUNX2、ALP和OCN表达降低。体外成脂诱导后,ASXL2敲低的人牙周膜干细胞成脂相关基因DGAT1表达降低。3.Western blot实验表明与对照组相比,成骨诱导14天后ASXL2敲低的人牙周膜干细胞OCN表达水平显著降低。4.Western blot实验证实,体外成骨诱导7天后,ASXL2敲低的人牙周膜干细胞H2AK119ub,H3K27me3表达水平升高,H3K4me3表达水平降低。5.KEGG富集分析结果显示,ASXL2敲低后差异表达基因富集ECM-receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway等信号通路。GO分析显示差异基因的分子功能主要与蛋白结合、Wnt蛋白结合等有关,涉及的细胞成分主要与胞外基质、染色质、细胞连接等有关,参与的生物过程主要与多细胞器官发育、细胞黏着、细胞间信号交流有关。结论:1.ASXL2敲低促进牙周膜干细胞成骨诱导后增殖,抑制牙周膜干细胞凋亡;2.ASXL2对牙周膜干细胞体外成骨分化能力至关重要、不可或缺;3.ASXL2调节牙周膜干细胞体外成骨分化有可能通过下调成骨基因H2AK119ub、H3K27me3蛋白修饰水平,上调成骨基因H3K4me3蛋白修饰水平以促进成骨基因转录;4.ASXL2可能通过影响多个成骨信号通路、细胞组分、分子功能参与多种生物学过程,参与牙周膜干细胞命运决定。