脂肪间充质干细胞来源外泌体的分离鉴定及其对大鼠颈动脉球囊损伤的影响

来源 :福建医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:illjyf
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目的:1.提取ADMSCs-Exo(adipose-derived mesenchymal stem cells derived exosomes,脂肪间充质干细胞来源外泌体),并鉴定其生物学特性。2.观察ADMSCs-Exo对大鼠颈动脉球囊损伤的影响。方法:1.ADMSCs(adipose-derived mesenchymal stem cells,脂肪间充质干细胞)分离培养、传代及鉴定:酶消化法培养ADMSCs,流式细胞技术检测第3代ADMSCs表面特异性抗原,同时诱导其向成脂、成骨分化,3周后观察细胞分化情况并分别用油红O及茜素红染色等鉴定。2.ADMSCs-Exo提取及鉴定:ADMSCs用去外泌体胎牛血清培养48小时后采用Exo-spin TM法提取外泌体,并通过TEM(transmission electron microscopy,透射电子显微镜)、NTA(nanoparticle tracking analysis,纳米颗粒追踪分析法)、WB(western blot,蛋白免疫印迹法)对其进行鉴定。3.观察ADMSCs-Exo对大鼠颈动脉球囊损伤的影响3.1大鼠颈动脉球囊损伤模型构建及分组:将45只体重约300~350g的雄性SD大鼠随机分为3组:对照组、损伤组、外泌体组。其中对照组行颈部皮肤切开缝合,外泌体组及损伤组构建颈动脉球囊损伤模型,同时静脉分别予外泌体及等量的生理盐水进行治疗。分别于术后14d、28d时处死大鼠,取左侧颈总动脉。3.2 HE(hematoxylin-eosin,苏木精-伊红)染色观察颈总动脉血管形态学改变;通过image成像法测定IA(intima area,内膜面积)、MA(media area,中膜面积),以内膜/中膜(I/M)比值评价颈动脉内膜增生水平。3.3伊文氏蓝染色观察血管内皮化情况,并以内皮化面积/血管总面积比值评价血管损伤修复水平。结果:1.ADMSCs细胞呈贴壁生长,形态多为长梭形,部分为多边形,并聚集性生长;第3代ADMSCs细胞流式学结果显示:CD29、CD90、CD34、CD45、CD31表达阳性率分别为87.6%、97.9%、37.9%、6.2%、0.9%;成脂诱导3周后镜下可见脂滴形成,呈圆形,部分融合成团块,形态饱满,油红O染色呈橘红色;成骨诱导3周后镜下可见细胞排列紊乱,显示不清,存在白色高密度物质,茜素红染色呈淡橘色;证实了分离培养的ADMSCs是符合MSCs(mesenchymal stem cells,间充质干细胞)国际标准。2.TEM下观察ADMSCs-Exo呈现出典型的圆形膜结构,内含低密度物质,NTA结果显示大部分粒子都处于30~150nm范围内,含量最多的粒径大小约为137.0nm,占99.4%,其浓度为4.1×10~6Particles/m L,符合外泌体的形态及大小;WB结果显示外泌体特异性抗体CD81表达阳性,与相关文献描述一致。3.ADMSCs-Exo对大鼠颈动脉球囊损伤内膜增生及内皮化影响3.1HE染色结果显示:在术后14d、28d时观察对照组大鼠颈总动脉血管结构完整,管腔正常,无新生内膜形成;损伤组管壁增厚,管腔狭窄,内弹力板被破坏,血管平滑肌细胞增殖活跃,内膜大量增生,而外泌体组相比损伤组管壁增厚、管腔狭窄及内膜增生程度明显减轻。计算IA、MA、I/M比值,结果显示术后14d时,外泌体组的I/M比值低于损伤组,差异有显著的统计学意义(0.18±0.01vs 0.27±0.06;n=5;P<0.05),在28d时也有显著的统计学差异(0.22±0.03 vs0.41±0.05;n=5;P<0.05)。3.2伊文氏蓝染色结果显示术后14d时:对照组血管内皮完整,未见明显内皮被染成蓝色;损伤组可见大面积片状不规则的血管内皮被染成蓝色;外泌体也可见到部分较规则血管内皮被染色;与对照组相比,损伤组内皮化面积/血管总面积比值显著降低(75.41±4.29%vs 97.49±0.98%;n=5;P<0.05),而外泌体组可改善球囊损伤后颈动脉内皮化,与损伤组相比,外泌体组内皮化面积/血管总面积比值显著增加(86.07±2.94%vs 75.41±4.29%;n=5;P<0.05)。结论:1.通过脂肪组织可获取具有多潜能分化的ADMSCs细胞;2.Exo-spin TM法可成功提取纯化ADMSCs细胞上清液外泌体;3.ADMSCs-Exo可抑制SD大鼠颈动脉损伤后内膜增生狭窄;4.ADMSCs-Exo可促进SD大鼠颈动脉损伤后内皮化。
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